本研究由来自Tagworks Pharmaceuticals的Maria Vlastara、Raffaella Rossin、Kim E. de Roode、Laurens H.J. Kleijn、Marc S. Robillard，来自Symo-Chem的Freek J.M. Hoeben，以及来自Radboud University Medical Center的Milou Boswinkel、James Nagarajah、Mark Rijpkema共同完成。该研究以题为“Click-to-release: cleavable radioimmunoimaging with [89Zr]Zr-DFO-trans-cyclooctene-trastuzumab increases tumor-to-blood ratio”的研究论文形式，发表于学术期刊《Theranostics》2023年第13卷第12期。
这项研究属于核医学与分子影像学领域，并交叉涉及化学生物学、放射化学及肿瘤靶向治疗。其核心背景在于，尽管放射性核素锆-89（89Zr）标记的单克隆抗体（mAbs）在肿瘤正电子发射断层扫描（PET）成像中应用广泛，但其在血液中循环时间过长的特性导致成像时背景信号高、图像质量下降，通常需要在注射后等待4-7天才能获得足够的肿瘤/血液（T/B）对比度，这增加了患者的辐射暴露和等待时间。为了解决这一长期存在的挑战，本研究旨在开发一种创新的“点击释放”（click-to-release）策略，利用生物正交化学反应，在抗体于肿瘤部位积累并内化后，选择性地在血液中释放放射性螯合剂，使其通过肾脏快速清除，从而显著提高肿瘤与背景的对比度，并有望实现同日成像。
研究的详细工作流程包含多个严谨的步骤。首先，研究团队设计并合成了一系列反式环辛烯（trans-cyclooctene, TCO）与去铁胺（deferoxamine, DFO）螯合剂相连的连接子-螯合剂构建体（共5种，编号为2, 4, 6, 7, 8）。这些构建体的区别在于聚乙二醇（PEG）间隔基的引入位置（TCO前、TCO后或两侧均有）和连接化学（NHS酯或马来酰亚胺），旨在调节亲水性和释放效率。随后，将这些构建体与靶向HER2受体的单抗曲妥珠单抗（trastuzumab, Tmab）进行偶联，并通过滴定法确定了每个抗体上连接的TCO数量（约1.2-2.5个）。接着，对偶联产物进行89Zr放射性标记，制备出[89Zr]Zr-TCO-Tmab复合物，并通过多种色谱方法（ITLC, SDS-PAGE, FPLC）验证了其高放射化学纯度（>95%）以及在人和小鼠血清中长达4天的体外稳定性。
在体外释放实验中，研究人员评估了不同TCO-Tmab构建体与两种四嗪（tetrazine）触发剂（9和10）的反应效率。他们将放射性标记的抗体与过量触发剂在磷酸盐缓冲液（PBS）或50%小鼠血浆中孵育24小时，然后使用尺寸排阻色谱（SEC）分析释放出的含[89Zr]Zr-DFO的小片段比例。结果显示，结合了前后均有PEG间隔基的构建体8（[89Zr]Zr-Tmab-8）与经过优化设计的触发剂10组合，在50%小鼠血浆中实现了83%的高释放率，因此被选为后续体内研究的候选对。
体内研究分阶段在健康小鼠和荷瘤小鼠中进行。在健康小鼠中，首先评估了[89Zr]Zr-Tmab-8的药代动力学，证实其血液清除呈双相模式（半衰期T1/2,α=1.86小时，T1/2,β=21.50小时），与未修饰的89Zr标记曲妥珠单抗相似，表明TCO修饰未显著改变抗体的体内行为。随后，在注射抗体1小时后给予触发剂10，发现血液中的放射性在24小时后降低了4倍（从16.08 %ID/g降至3.93 %ID/g），且第二次给予触发剂并未进一步降低放射性，证明第一次触发剂量已基本完成血液中的反应。此外，通过离体分析血液样本，测得TCO连接子在体内的失活半衰期长达16.5天，表明该体系在注射后允许一个较长的治疗时间窗口。
在BT-474乳腺癌细胞中进行的体外内化实验显示，[89Zr]Zr-Tmab-8与HER2阳性细胞结合迅速，6小时和24小时时细胞内化率分别达到56.8%和81.4%，为选择触发剂给药时间点提供了依据。最终，在携带BT-474肿瘤的小鼠模型中，研究人员测试了两个触发时间点：在注射[89Zr]Zr-Tmab-8后的6小时和24小时给予触发剂10，并在触发剂给药4小时后处死小鼠进行生物分布分析。
该研究获得了一系列关键结果。在荷瘤小鼠的生物分布实验中，触发剂的给药显著提高了肿瘤与血液的放射性摄取比值（T/B比）。当在抗体注射后6小时给予触发剂时，T/B比从对照组的1.0 ± 0.4提升至2.3 ± 0.6（p = 0.0057）；当在24小时给予触发剂时，T/B比从对照组的2.5 ± 0.7大幅提升至6.6 ± 0.9（p < 0.0001）。这表明，即使在肿瘤摄取相对较早的阶段（6小时）进行干预，也能有效改善对比度，而更晚的干预（24小时）则能获得更优的效果。此外，肿瘤与肝脏、肺等血供丰富器官的比值也得到显著改善。值得注意的是，触发剂处理并未导致肿瘤内放射性信号的显著流失（6小时组p=0.1793，24小时组p=0.9042），证实了内化到肿瘤细胞内的放射性抗体受到了保护，未被细胞外触发剂影响。
为了直观展示成像效果的改善，研究团队进行了小动物PET成像研究。小鼠在注射[89Zr]Zr-Tmab-8后5小时进行第一次扫描（触发前），然后在6小时注射触发剂，并于触发剂注射后4小时进行第二次扫描。成像结果清晰显示，触发前扫描（Scan 1）中由于高血池背景，肿瘤显影不清（肿瘤/心脏比=0.9 ± 0.1）。而在触发后扫描（Scan 2）中，背景信号（特别是心脏和血池）大幅降低，肿瘤显影对比度显著增强（肿瘤/心脏比提升至2.4 ± 0.7，p=0.0229），并且释放的小片段主要通过肾脏和膀胱清除。这首次在活体水平上证明了“点击释放”化学可用于实现放射性螯合剂从抗体上的选择性释放，并成功改善PET成像质量。
本研究的结论是，成功开发并验证了一种基于反式环辛烯-四嗪“点击释放”化学的新型可切割放射性免疫成像平台。该平台能够在小鼠体内实现时间可控的、高效的放射性螯合剂从抗体上的切割，从而在保留肿瘤内信号的同时，快速清除血液中的放射性背景，显著提高肿瘤/血液比值。这为克服传统89Zr标记抗体PET成像等待时间长、背景高的瓶颈提供了创新性解决方案。
该研究的科学价值和应用前景十分显著。在科学上，它首次将“点击释放”这一先进的生物正交化学工具应用于放射性免疫成像领域，拓展了该化学反应在体内应用的范围，为可控的“在体”化学修饰提供了新范例。在应用上，该方法有望将基于全长抗体的PET成像时间从数天缩短至同一天，减少患者的辐射剂量和等待时间，提高诊疗效率。此外，该策略不仅适用于靶向内化受体的抗体（如本研究的HER2），也可能有益于旨在穿越血脑屏障的抗体成像，选择性降低脑部血池背景。更重要的是，该平台具有向放射性免疫治疗（RIT）转化的潜力，通过降低骨髓等正常组织的辐射剂量，可能允许向肿瘤递送更高的治疗剂量，从而提高治疗指数。
本研究的亮点在于：第一，方法的创新性：首次将“点击释放”化学应用于放射性核素标记抗体的可控切割，实现了对成像探针药代动力学的“时空调控”。第二，显著的成像效果改善：在动物模型中，将肿瘤/血液比最高提升了2.6倍，并通过PET影像直观证实了同日成像的可行性。第三，精巧的分子设计：通过系统优化TCO-DFO连接子结构和四嗪触发剂，获得了在血浆环境中高释放效率且体内稳定的最佳组合（Tmab-8/触发剂10）。第四，坚实的机制验证：研究不仅展示了最终效果，还通过详细的体外释放、体内稳定性、药代动力学和内化实验，完整阐明了其作用机制和时效关系，为后续研究和临床转化奠定了坚实基础。
其他有价值的内容还包括研究中对TCO连接子体内稳定性的精确测定（半衰期16.5天），这为确定治疗时间窗口提供了关键参数；以及研究指出，由于人体内抗体清除更慢而肿瘤内化速率可能相似，该策略在临床应用中可能带来更大幅度的血液辐射剂量降低，前景令人期待。这项研究为改善抗体类放射性药物的成像和治疗性能开辟了一条极具潜力的新途径。