本研究由来自美国宾夕法尼亚大学（University of Pennsylvania）多个实验室的Liang-Chuan S Wang、Albert Lo、Steven M Albelda、Ellen Puré及Carl H June等主要研究者合作完成，于2014年2月发表在《Cancer Immunology Research》期刊上（Cancer Immunol Res. 2014 Feb; 2(2): 154–166. doi:10.1158⁄2326-6066.CIR-13-0027）。
学术背景与研究目的 该研究属于肿瘤免疫治疗领域，具体聚焦于嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cells, CAR-T）疗法。传统CAR-T研究主要集中于直接靶向并杀伤肿瘤细胞本身，但面临着肿瘤细胞抗原异质性、免疫逃逸等挑战。本研究提出了一个创新的策略：将肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中非癌变的、但促进肿瘤生长的基质细胞作为CAR-T细胞治疗的新靶点。肿瘤相关基质细胞，特别是癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs），通过形成物理屏障、分泌生长因子和免疫抑制因子等方式，支持肿瘤生长、侵袭、转移并削弱抗肿瘤免疫反应，是肿瘤治疗的重要障碍。
成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP）是CAFs上高度表达的一种跨膜丝氨酸蛋白酶，在绝大多数上皮来源的实体瘤基质中广泛存在，而在大多数正常成人静止期基质细胞中不表达或表达极低，这使其成为一个有潜力的治疗靶点。然而，先前有研究通过基因手段完全消融FAP+细胞导致了贫血和恶病质等严重毒性，提示靶向FAP存在安全风险。同时，其他研究小组使用不同抗体构建的抗FAP CAR-T细胞在疗效和毒性上报告了矛盾的结果。因此，本研究旨在深入探究在免疫功能完整的小鼠模型中，使用靶向FAP的CAR-T细胞治疗实体瘤的可行性、有效性、作用机制及安全性，以期为后续临床转化提供关键依据。
详细研究流程与实验设计 本研究是一项系统的临床前研究，流程涵盖CAR构建、体外功能验证、多个体内肿瘤模型疗效评估、作用机制探索、安全性评价及联合治疗策略尝试。
第一， CAR-T细胞的构建与体外功能验证。 1. 抗体与CAR构建：研究团队首先通过免疫FAP敲除（FAP-null）小鼠，筛选并获得了特异性识别小鼠FAP的单克隆抗体73.3。该抗体不与人FAP交叉反应，且对小鼠FAP具有高亲和力（ nM）。随后，他们将73.3抗体的单链可变区片段（scFv）与不同的胞内信号域结合，构建了多种二代CAR结构。主要构建体有两种：一种是包含人源CD8α铰链/跨膜区、人源4-1BB（CD137）和CD3ζ共刺激/激活结构域的“73.3-hBBζ” CAR；另一种是完全鼠源的“73.3-m28ζ” CAR，包含小鼠CD28和CD3ζ信号域。此外，还构建了缺乏共刺激域（仅含CD3ζ）的第一代CAR作为对照。这些CAR被克隆到逆转录病毒载体（如MIGR1，含GFP报告基因）中。 2. T细胞转导与扩增：从C57BL/6或BALB/c小鼠脾脏中分离原代T细胞，经抗CD3/CD28抗体激活后，用上述逆转录病毒上清进行转导，获得表达CAR的T细胞（FAP-CAR T）。对照T细胞仅转导空载体（MIGR1）。 3. 体外功能测试： * 激活与信号通路：将FAP-CAR T细胞与包被有重组FAP蛋白（FAP-ECD）的磁珠共孵育，通过流式细胞术检测T细胞活化标志物CD69的上调，并通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测下游信号通路蛋白（如p-ERK, p-AKT, p-IKKα/β）的磷酸化，证实CAR能够特异性识别FAP抗原并激活T细胞。 * 细胞因子分泌与细胞毒性：将FAP-CAR T细胞与表达FAP的小鼠成纤维细胞（3T3.FAP）或其亲本不表达FAP的细胞（3T3）共培养。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中干扰素-γ（IFNγ）的分泌，并通过基于荧光素酶的细胞毒性实验检测对靶细胞的杀伤能力。结果显示，FAP-CAR T细胞能特异性杀伤3T3.FAP细胞并分泌大量IFNγ，而对3T3细胞无作用，证明了其抗原特异性的效应功能。
第二， 体内抗肿瘤疗效评估。 1. 肿瘤模型建立：研究使用了多种不表达FAP的皮下移植瘤模型，包括AE17.OVA间皮瘤细胞、TC1和LKR肺癌细胞（C57BL/6背景），以及CT26结肠癌细胞和4T1乳腺癌细胞（BALB/c背景）。这些模型旨在模拟FAP表达于宿主来源的肿瘤基质细胞，而非肿瘤细胞本身的情况。 2. 疗效实验设计：当小鼠肿瘤生长至约100-150 mm³时，通过尾静脉单次注射1×10^7个FAP-CAR T细胞或对照MIGR1 T细胞，或不作处理。随后定期测量肿瘤体积。 3. 主要疗效结果：在免疫功能正常的野生型小鼠中，单次输注FAP-CAR T细胞能显著抑制所有测试肿瘤模型的生长（抑制率35-50%），而对照T细胞无效。为了验证疗效依赖于FAP靶点，研究在FAP敲除小鼠中建立了AE17.OVA肿瘤，结果显示FAP-CAR T细胞失去了抗肿瘤效果，确证了其作用具有FAP特异性。 4. 肿瘤内FAP+细胞分析：在输注CAR-T细胞后不同时间点（如第3、7-9天）处死小鼠，获取肿瘤组织制备单细胞悬液，通过多色流式细胞术分析肿瘤微环境变化。结果发现，治疗后肿瘤内FAP高表达（FAPhi）的CD45-CD90+基质细胞和FAP+CD45+白细胞亚群被显著选择性清除（如第3天FAPhi基质细胞减少82%），而FAP低表达（FAPlo）的细胞受影响较小。这揭示了治疗的主要直接作用是清除肿瘤内的FAPhi基质细胞。
第三， 作用机制探究。 1. 适应性免疫系统的作用：为了探究内源性免疫系统是否参与疗效，研究在免疫缺陷的NSG小鼠中重复了AE17.OVA模型实验。结果显示，FAP-CAR T细胞在NSG小鼠中完全丧失了抗肿瘤活性，尽管肿瘤基质中FAP表达水平与免疫健全小鼠相似。这强烈表明FAP-CAR T细胞的疗效需要宿主完整的适应性免疫系统参与。 2. 内源性抗肿瘤免疫反应的增强：在免疫健全小鼠模型中，分析肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）发现，FAP-CAR T细胞治疗后，肿瘤内总的CD8+ T细胞以及肿瘤抗原特异性（如针对TC1的HPV-E7抗原或AE17.OVA的OVA抗原）的CD8+ T细胞数量显著增加。动态分析显示，治疗后第3天，肿瘤内CD4+ T细胞产生肿瘤坏死因子-α（TNFα）的水平升高；到第8天，CD8+ T细胞的浸润、活化标志物CD69的表达以及IFNγ的产生均显著增加。这表明FAP-CAR T细胞通过清除免疫抑制性基质，激活并招募了内源性的抗肿瘤T细胞，从而放大了整体的抗肿瘤免疫反应。
第四， 增强疗效的策略探索。 1. 多次输注：鉴于小鼠CAR-T细胞在体内持久性较短（输注后数量迅速下降），研究尝试了在首次输注一周后进行第二次FAP-CAR T细胞输注。结果显示，两次输注比单次输注能更有效地抑制肿瘤生长。 2. 改造T细胞功能：利用二酰基甘油激酶ζ（Diacylglycerol kinase ζ, DGKζ）缺陷型小鼠（该酶缺失可增强T细胞活化）来源的T细胞构建FAP-CAR T细胞。体外实验证实DGKζ缺陷的FAP-CAR T细胞具有更强的杀伤活性和细胞因子分泌能力。体内实验显示，与野生型FAP-CAR T细胞相比，DGKζ缺陷型能更有效地控制肿瘤生长，且体内持久性更好。 3. 联合治疗：将FAP-CAR T细胞与肿瘤疫苗（表达HPV-E7抗原的腺病毒疫苗，Ad.E7）联用，治疗已形成较大体积（~200 mm³）的TC1肿瘤。结果显示，单独使用疫苗或CAR-T细胞效果有限，但两者联合产生了协同抗肿瘤效应，导致了肿瘤的暂时消退。
第五， 安全性评估。 与之前某些报道不同，本研究未观察到严重的“脱靶/在瘤”毒性（on-target/off-tumor toxicity）。在接受单次或两次野生型FAP-CAR T细胞治疗的小鼠中，未出现体重减轻、贫血或血清淀粉酶升高等不良反应。详细的组织病理学检查（心、肺、胰腺、肝、脾、肾、骨骼肌、骨髓）也未发现异常，特别是未出现之前报道的骨髓增生不良或肌肉损伤。仅在输注高活性的DGKζ缺陷型FAP-CAR T细胞后，在部分小鼠胰腺中观察到轻微的局灶性血管周围和胰岛周围淋巴细胞浸润，但未引起临床症状。作者分析，其CAR-T细胞（使用73.3 scFv）与之前报告引起毒性的研究（使用FAP-5 scFv）所靶向的FAP表位可能不同，导致其能更选择性地清除肿瘤内高表达FAP的细胞，而相对 sparing表达较低水平FAP的正常组织（如胰腺、骨髓、肌肉）细胞，从而在保持疗效的同时避免了严重毒性。
结论与意义 本研究的核心结论是：在免疫功能完整的宿主中，采用靶向肿瘤基质细胞标志物FAP的CAR-T细胞进行治疗，能够通过特异性清除肿瘤相关FAPhi基质细胞，进而激发和增强宿主内源性的抗肿瘤CD8+ T细胞免疫应答，从而有效抑制多种实体瘤的生长。这一策略展示了良好的安全性，未引起严重的系统性毒性。
研究的科学价值与应用价值： 1. 概念创新：成功验证了将肿瘤微环境中的基质细胞，而非肿瘤细胞本身，作为CAR-T细胞治疗靶点这一新策略的可行性。这为克服肿瘤细胞抗原异质性和免疫逃逸提供了新思路。 2. 机制深入：阐明了抗FAP CAR-T细胞的作用不仅在于直接杀伤靶细胞，更关键的是通过改变免疫抑制性微环境，从而“解放”和增强内源性抗肿瘤免疫，这为联合其他免疫疗法（如疫苗、检查点抑制剂）提供了坚实的理论依据。 3. 安全性数据重要：提供了关键证据，表明通过选择合适的靶向表位和/或控制CAR-T细胞的活性水平，有可能在实现抗肿瘤疗效的同时，避免针对FAP治疗可能引发的严重毒性（如恶病质、贫血），缓解了对此类疗法安全性的担忧。 4. 临床转化启示：研究支持进一步开发针对人FAP的CAR-T细胞用于临床。文中还提到，采用可降解的mRNA转导CAR-T细胞等临时性策略，可能有助于进一步控制潜在风险。
研究亮点 1. 靶点选择的创新性：将CAR-T疗法从直接攻击癌细胞拓展到攻击肿瘤赖以生存的“土壤”——基质细胞，开辟了实体瘤CAR-T治疗的新方向。 2. 模型系统的完整性：研究在多种免疫健全的 syngeneic 小鼠肿瘤模型中进行，能够全面评估CAR-T细胞在真实免疫微环境中的疗效、持久性和对宿主免疫系统的影响，结论更具生理相关性。 3. 机制研究的系统性：不仅证明了疗效，还通过FAP敲除鼠、免疫缺陷鼠、流式细胞术动态监测肿瘤免疫微环境变化等多重手段，深入揭示了其依赖于内源性适应性免疫的作用机制。 4. 对矛盾结果的回应与解释：针对同一领域其他研究报道的严重毒性或疗效不佳，本研究通过使用不同的scFv、在免疫健全模型中测试、并细致分析FAP表达差异，对可能的原因（如表位差异、免疫系统状态、基质含量）进行了探讨，推动了领域认知。 5. 联合治疗探索：初步展示了FAP-CAR T细胞与疫苗联合治疗的协同潜力，为优化治疗方案提供了方向。
其他有价值的内容 研究还探讨了小鼠CAR-T细胞在体内持久性短的问题，并将其归因于小鼠T细胞与人T细胞在体外激活和体内存活特性上的固有差异。通过构建全鼠源CAR和使用DGKζ缺陷型T细胞来增强功能与持久性的尝试，为改进临床前小鼠模型中的CAR-T研究提供了实用见解。此外，研究对比了不同共刺激域（4-1BB vs CD28）在小鼠模型中的效果，发现其抗肿瘤活性相似，这为CAR结构的设计提供了参考。