《TTYH3/MK5正反馈循环通过GSK3-β/β-catenin信号通路调控肝细胞癌进展》学术报告

一、作者与发表信息
本研究由青岛大学附属医院肝胆胰外科的王艺秀（Yixiu Wang）、谢宇威（Yuwei Xie）等共同完成，通讯作者为朱成瞻（Chengzhan Zhu）、曹景玉（Jingyu Cao）和董茜（Qian Dong）。合作机构包括青岛大学附属医院数字医学与计算机辅助手术山东省重点实验室、日本德岛大学医学科学研究所等。论文于2022年6月21日发表于《International Journal of Biological Sciences》（IJBS），卷18期10，页码4053-4070，DOI: 10.7150/ijbs.73009。

二、学术背景
肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，手术切除后早期复发和转移是预后不良的关键因素。尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂有所进展，晚期HCC中位生存期仍不足两年。离子通道在癌症发展中广泛参与病理生理过程，但Tweety同源蛋白3（TTYH3）作为钙激活氯通道（Ca2+-activated Cl- channel）在HCC中的作用尚未明确。本研究旨在揭示TTYH3在HCC中的生物学功能、临床意义及其分子机制。

三、研究流程与实验设计
1. 体外功能实验
- 细胞模型：选取TTYH3表达水平差异显著的HCCLM3（高表达）和Hep3B（低表达）细胞系。
- 功能验证：通过CCK-8、克隆形成实验证实TTYH3过表达促进增殖，而敲低抑制增殖；流式细胞术显示TTYH3过表达减少细胞凋亡。划痕实验和Transwell实验表明TTYH3增强迁移和侵袭能力，免疫荧光显示其通过调节细胞骨架（微丝）促进运动。
- 离子通道功能：Fluo-3 AM钙荧光探针和MQAE氯离子荧光指示剂证实TTYH3促进钙内流和氯离子浓度升高，且CaCl2处理可增强迁移，被钙螯合剂BAPTA逆转。

1. 体内实验

   • 皮下移植瘤模型：将稳定表达TTYH3的HCCLM3细胞注射至裸鼠背部（n=7），4周后肿瘤体积和重量显著增加（p<0.01），免疫组化显示Ki-67表达升高。
     
   • 肺转移模型：尾静脉注射后，TTYH3过表达组肺转移结节数量显著多于对照组（p<0.001），H&E染色确认转移灶形态。
     

2. 分子机制探索

   • 蛋白质互作：通过免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱分析发现TTYH3与MK5（MAPK-activated protein kinase 5）相互作用，蛋白质对接模拟揭示其结合界面。
     
   • 信号通路：Western blot显示TTYH3通过MK5激活GSK3β/β-catenin通路，上调p-GSK3β（Ser9）、β-catenin、c-Myc和Cyclin D1，下调E-cadherin。MK5敲低可逆转TTYH3的促转移效应。
     
   • 甲基化调控：850K甲基化芯片和焦磷酸测序发现HCC组织中TTYH3启动子区CpG位点（如cg00798876）低甲基化（p<0.05），与mRNA表达正相关。
     

3. 临床数据分析

   • 样本队列：140例青岛大学附属医院和58例德岛大学HCC患者的肿瘤与非肿瘤组织对比显示TTYH3 mRNA和蛋白（免疫组化）在肿瘤中高表达（p<0.01）。
     
   • 预后关联：高TTYH3表达与患者无病生存期（DFS）和总生存期（OS）缩短显著相关（TCGA数据库验证，p<0.05），多因素分析确认其独立预后价值。
     

四、主要结果与逻辑链条
1. 功能表型：TTYH3通过钙/氯离子内流促进EMT（上皮-间质转化），激活MK5/GSK3β/β-catenin轴，驱动增殖和转移。
2. 分子互作：TTYH3与MK5形成正反馈循环，MK5上调进一步强化β-catenin信号。突变体实验证实结合界面关键性。
3. 临床证据：TTYH3高表达与HCC进展和不良预后一致，甲基化调控解释其转录上调机制。

五、结论与价值
本研究首次阐明TTYH3作为离子通道通过MK5/GSK3β/β-catenin通路促进HCC转移的机制，并提出其作为预后标志物和治疗靶点的潜力。科学价值在于揭示了离子通道在肿瘤代谢重编程中的新角色，应用价值为HCC的分子分型和靶向干预提供新思路。

六、研究亮点
1. 创新发现：首次报道TTYH3-MK5正反馈循环及其在HCC中的促癌作用。
2. 方法整合：结合蛋白质对接、甲基化组学和体内外模型，多维度验证机制。
3. 临床转化：通过大样本队列和TCGA数据强化结论的普适性。

七、其他价值
研究还发现TTYH3可诱导HCC细胞对乐伐替尼（lenvatinib）耐药（附图S6），为联合治疗策略提供依据。此外，生物信息学分析提示TTYH3在胃癌、胰腺癌中可能具有类似功能，值得进一步探索。