本文是由圣犹大儿童研究医院（St. Jude Children’s Research Hospital）等多家机构的Brennan P. Bergeron、Jonathan D. Diedrich、Daniel Savic等作者共同完成的一项原创性研究，发表于《白血病》（Leukemia）期刊2022年8月26日在线发表的第36卷第2374至2383页。
本研究聚焦于儿童急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL）治疗领域的一个关键临床问题——糖皮质激素（Glucocorticoids, GCs）耐药。糖皮质激素是当代儿童ALL多药化疗方案的基石，但其耐药性与ALL复发及不良临床预后高度相关，是进一步提高患者生存率的主要障碍。尽管先前研究已识别出一些与GC耐药相关的基因，但关于顺式调控元件（cis-regulatory elements）的破坏如何影响GC耐药的机制仍知之甚少。为此，本研究旨在全面绘制ALL细胞对GC反应的基因调控图谱，并整合原发性ALL患者样本的遗传与表观遗传数据，以期揭示影响GC耐药的顺式调控紊乱机制。
研究的详细工作流程包含多个相互关联的步骤，整合了多种先进的功能基因组学和高通量技术。首先，研究者选择了两个具有代表性且对GC敏感的人B细胞ALL细胞系（697和NALM6）作为模型系统。这两个细胞系分别代表儿童ALL中常见的TCF3-PBX1和DUX4/ERG分子亚型，且易于培养和转染，便于进行深入的机理研究。研究团队在泼尼松龙（一种GC）处理后的不同时间点（0、2、6、12、24小时），对这两个细胞系进行了一系列功能基因组学分析，包括：1）ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）以检测染色质可及性变化；2）ChIP-seq针对组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）修饰，以标记活跃的增强子等调控元件；3）ChIP-seq针对糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor, GR）以绘制其全基因组结合位点；4）RNA-seq以分析基因表达变化；5）H3K27ac HiChIP以捕获三维基因组中远端调控元件与启动子之间的长程相互作用。这一时间进程设计旨在动态捕捉GC引发的早期和晚期分子事件。
其次，为了功能性地验证GC响应性染色质区域（特别是那些GR占据的位点）的调控活性，研究团队开发并应用了一种名为ATAC-STARR-seq的高通量报告基因检测方法。该方法将ATAC-seq获得的染色质开放区域DNA片段克隆到一个特殊的报告质粒载体中，该载体能使具有增强子活性的片段自我转录产生RNA。将质粒文库转染回ALL细胞系，并在有或无GC处理的条件下培养，随后通过测序比较RNA输出与DNA输入，即可在全基因组范围内鉴定出具有转录激活活性的序列，并评估其GC响应性。这种方法可以大规模并行地验证成千上万个潜在调控元件的功能。
第三，为了将细胞系模型中的发现与临床耐药性联系起来，研究整合了来自St. Jude儿童医院TOTAL XVI临床试验（NCT00549848）的患者样本数据。这些数据包括：原发性ALL细胞的体外GC药物敏感性（对泼尼松龙和地塞米松的反应）、基因表达谱（RNA-seq）、DNA甲基化数据、单核苷酸变异（SNV）基因分型以及染色质可及性数据（Fast-ATAC）。通过生物信息学方法，研究者寻找患者样本中与GC耐药性相关的遗传变异和表观遗传改变，并重点考察这些改变是否发生在细胞系模型中定义的GR占据的高置信度顺式调控元件（文中定义为同时具有GR结合、染色质可及性和H3K27ac信号的位点，简称hGRs）上。
第四，为了直接筛选在GC耐药中起关键作用的hGRs，研究团队进行了CRISPR干扰（CRISPRi）筛选。他们针对与患者GC耐药性相关的染色质可及性位点中的GR结合区域，设计了超过11000个单向导RNA（sgRNA），用于在697和NALM6细胞系中靶向抑制这些潜在调控元件的功能。经过GC药物处理筛选后，通过测序分析sgRNA的富集情况，可以鉴定出那些当被抑制时会导致细胞对GC产生抵抗力的hGRs，从而将表观遗传关联转化为功能因果性证据。
最后，对通过上述整合分析筛选出的关键候选hGRs及其关联基因，研究使用了CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行功能性验证。通过在细胞系中精确删除特定的hGRs或敲除其靶基因，然后检测GC处理后的基因表达变化和细胞存活率，来确认这些顺式调控元件在GC响应和耐药中的具体作用。
研究取得了一系列重要结果。首先，在细胞系模型中发现GC处理对ALL细胞的染色质景观产生了深远影响。GC引发了数千个染色质可及性和H3K27ac修饰位点的变化，并诱导形成了超过250个GC响应性超级增强子（super-enhancers）。特别值得注意的是，研究观察到AP-1转录因子家族的结合在GC处理后显著减少。AP-1通常与细胞增殖和抗凋亡过程相关，其结合位点的抑制与GC诱导的促凋亡转录程序相吻合。HiChIP数据进一步将许多发生GC响应性变化的hGRs与差异表达基因的启动子通过三维空间环化连接起来，建立了染色质状态变化与基因表达调控之间的直接物理联系。
ATAC-STARR-seq结果成功验证了数千个GC响应性染色质开放区域具有增强子活性，其中大部分与hGRs重叠。这为细胞系中定义的调控元件提供了直接的功能证据。
在连接机制与临床表型方面，研究取得了关键发现。通过分析患者数据，研究者发现了一个位于TLE1基因内的遗传变异rs7045812。该变异改变了该位点的一个糖皮质激素反应元件（Glucocorticoid Response Element, GRE）序列。携带破坏性等位基因（T等位基因）的患者原发性ALL细胞表现出更强的GC耐药性。报告基因实验证实，含有T等位基因的DNA片段其GC响应性显著低于参考等位基因（C等位基因）。在NALM6细胞中利用CRISPR/Cas9删除包含该变异的hGR区域，同样导致了TLE1表达降低和GC耐药性增加。这些结果共同证明，遗传变异通过破坏GR结合位点，影响靶基因（TLE1）表达，进而导致GC耐药。
除了遗传变异，表观遗传改变也被发现是驱动耐药的重要机制。整合患者染色质可及性数据和CRISPRi筛选，研究者鉴定出多个在GC耐药样本中可及性降低（即表观遗传学上被“关闭”或“遮挡”）且功能筛选显示重要的hGRs。其中两个亮点案例是TLE1和ROR1基因座。对于TLE1，除了上述的遗传变异，研究者还发现一个位于该基因下游的远端hGR（peak1585）在GC耐药患者样本中可及性降低且DNA甲基化升高。删除该hGR会降低TLE1表达并增加GC耐药。对于ROR1基因座，发现了三个与耐药相关的hGRs（peak42, peak43, peak44）。有趣的是，ROR1是一个被GC抑制的基因（即GC对其的作用是抗凋亡的）。在GC耐药样本中，这些hGRs同样呈现可及性降低和DNA甲基化升高，且ROR1表达较低。功能实验表明，删除其中两个关键的远端hGRs（peak42和peak43）会削弱GC对ROR1的抑制能力，反而使得细胞对GC更为敏感。这表明，GC通过某些hGRs抑制像ROR1这样的抗凋亡基因，当这些hGRs被表观遗传学沉默时，会破坏这种抑制，导致耐药。
基于以上结果，本研究得出结论：糖皮质激素在白血病表观基因组上引发广泛效应，其对染色质状态和三维结构的重塑是诱导细胞凋亡的核心环节。更重要的是，遗传变异和表观遗传改变所导致的GC响应性基因调控网络（特别是hGRs）的破坏，是儿童ALL中GC耐药的一个重要先前未被充分认识的机制。研究特别指出，TLE1和ROR1基因座的案例提示，Wnt信号通路（TLE1参与经典Wnt信号抑制，ROR1参与非经典Wnt信号激活）的顺式调控紊乱可能是GC耐药的一个共同机制。此外，研究揭示了GC的基因调控作用并非全是促凋亡的，其对某些抗凋亡基因（如ROR1）的抑制性调控若被破坏，同样会促进耐药。
本研究的亮点在于：1）系统性：首次在ALL中综合运用多种前沿组学技术（表观基因组、转录组、三维基因组）和高通量功能验证手段（STARR-seq, CRISPRi），多维度、动态地绘制了GC的基因调控响应全景图。2）临床转化性：紧密整合细胞系模型与大量原发性患者样本的多组学数据及药敏表型，将基础发现与临床耐药直接关联，实现了从关联到功能、再到因果机制的完整证据链构建。3）机制新颖性：超越了以往主要关注编码基因突变或表达变化的视角，深入揭示了顺式调控元件的遗传和表观遗传破坏在GC耐药中的关键作用，并提供了TLE1和ROR1等多个具体的机制案例。4）方法创新性：应用并优化了ATAC-STARR-seq这一组合技术，高效地实现了对染色质开放区域的大规模功能注释，为类似研究提供了方法学参考。
这项研究不仅深化了对糖皮质激素在ALL中作用分子机制的理解，更重要的是为儿童ALL的GC耐药提供了新的解释框架和潜在的治疗靶点。未来，针对这些被破坏的顺式调控元件或其下游通路（如Wnt信号）进行干预，可能为克服GC耐药、改善高危ALL患儿预后开辟新的策略。