类型a：学术研究报告

主要作者及机构
本研究由Judy Ruckman‡§、Louis S. Green‡、Jim Beeson‡等来自‡Nexstar Pharmaceuticals, Inc.（美国科罗拉多州博尔德）和¶瑞典乌普萨拉大学生物医学中心（Department of Medicinal and Physical Chemistry）的团队合作完成，成果发表于1998年8月的*The Journal of Biological Chemistry*（卷273，期32，页20556–20567）。

学术背景
研究聚焦于血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）的调控。VEGF是病理性血管生成（如肿瘤生长、糖尿病视网膜病变）的核心正调控因子，其通过结合受体（如KDR、Flt-1）促进内皮细胞增殖与血管通透性。VEGF165（含165个氨基酸的亚型）因包含外显子7编码的肝素结合域而具有更强的生物学活性。本研究旨在通过SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，配体指数富集系统进化）技术筛选高亲和力、高特异性的2’-氟嘧啶RNA适配体（aptamer），以阻断VEGF165的功能，为抗血管生成治疗提供新策略。

研究流程与方法
1. SELEX筛选适配体
- 文库设计：构建含30或40个随机核苷酸的2’-氟嘧啶RNA文库（保留嘌呤2’-OH以维持聚合酶活性），固定区包含T7启动子序列。
- 筛选条件：12轮筛选，逐步降低VEGF165与RNA浓度（从μM至pM级），采用硝酸纤维素膜过滤法分离复合物，并通过RT-PCR扩增富集结合序列。第5–6轮改用非变性凝胶电泳去除非特异性结合RNA。
- 克隆与测序：筛选后克隆143个序列，归类为3个家族（Family 1–3），代表性克隆（如VP30.22、VP30.2、VT30.44）通过截断实验确定最小结合单元（23–29 nt）。

1. 适配体优化与修饰

   • 2’-O-甲基化（2’-OME）修饰：在嘌呤位点引入2’-OME以提高核酸酶抗性。通过碱水解实验鉴定耐受位点（如Family 1的G4/A6不可修饰），最终获得3种最小化适配体（T22-OME、T2-OME、T44-OME），解离常数（Kd）为49–130 pM。
     
   • 热稳定性分析：圆二色谱显示2’-F/2’-OME修饰显著提升Tm值（48–66°C），表明结构刚性增强。
     

2. 结合特性与机制

   • 特异性验证：适配体结合VEGF165及鼠源VEGF164，但不识别VEGF121或胎盘生长因子（PlGF129）。异源二聚体VEGF165/PlGF129结合亲和力降低（Kd 430–40 nM），提示结合界面涉及双亚基协同作用。
     
   • 光交联定位：5-碘尿苷（5-I-U）标记显示，3种适配体均与外显子7编码域的Cys137交联，证实该残基为关键结合位点。
     

3. 功能抑制实验

   • 受体结合抑制：在转染猪主动脉内皮细胞（PAE）中，适配体抑制VEGF165与KDR（IC50 2–60 pM）及Flt-1（IC50 50–300 pM）的结合，其中T44-OME抑制活性最强。
     
   • 体内血管通透性抑制（Miles assay）：T44-OME（0.1 μM）显著抑制豚鼠皮内VEGF诱导的Evans蓝渗出（抑制率48%），40 kDa PEG偶联后效果提升至83%。
     

主要结果与逻辑关联
- 筛选与优化：SELEX成功获得3家族适配体，截断与修饰后维持高亲和力（Kd <130 pM），且2’-F/2’-OME修饰增强稳定性（图1碱水解数据与Tm值）。
- 机制解析：光交联与异源二聚体实验证明适配体靶向VEGF165的Cys137及邻近外显子7域，阻断受体结合界面（图4交联肽段测序）。
- 功能验证：体外抑制受体结合（图5竞争曲线）与体内抑制血管通透性（图6 Miles assay）形成闭环证据链，支持适配体的治疗潜力。

结论与价值
1. 科学价值：首次报道2’-氟嘧啶适配体通过外显子7域特异性抑制VEGF165，揭示Cys137为关键作用位点，为VEGF异构体功能差异提供新见解。
2. 应用价值：适配体兼具高亲和力（pM级）、核酸酶抗性（2’-OME修饰）及体内活性（PEG增效），为抗血管生成药物开发提供新候选分子。

研究亮点
- 技术创新：SELEX结合2’-F/2’-OME化学修饰，突破传统RNA适配体的稳定性瓶颈。
- 发现新颖性：首次定位适配体-VEGF交联于Cys137，阐明外显子7域的药理学意义。
- 转化潜力：T44-OME的体内有效性为治疗视网膜病变、肿瘤等VEGF依赖性疾病奠定基础。

其他价值
研究还发现钙离子（Ca²⁺）对Family 3适配体（如T44-OME）的结合至关重要（图2螯合实验），提示二价金属离子在核酸-蛋白相互作用中的调控作用，为后续机制研究提供方向。