该文档报告了一项单一的原创性研究。以下是其学术报告：

本研究的主要作者为Ana Cláudia Camargo Miranda（通讯作者），以及Sofia Nascimento dos Santos、Leonardo Lima Fuscaldi、Luiza Mascarenhas Balieiro、Maria Helena Bellini、Maria Inês Calil Cury Guimarães和Elaine Bortoleti de Araújo。作者主要来自巴西圣保罗的以色列爱因斯坦医院研究所以及核能研究所等单位。该研究于2021年6月27日发表在期刊 *Pharmaceutics*（2021年卷13期，文章编号971）上。

本研究隶属于核医学、放射性药物化学与肿瘤靶向治疗交叉领域。其学术背景在于，人表皮生长因子受体2（HER2）是肿瘤学中一个重要的分子靶点，与疾病侵袭性和不良预后相关。特别是在约20-30%的乳腺癌病例中存在HER2过表达。目前，针对HER2的诊断方法主要是侵入性活检，其结果可能因肿瘤内异质性而不一致，且重复活检有促进转移的风险。因此，开发非侵入性成像技术和靶向治疗方法成为一个快速发展的领域。利用放射性核素标记的单克隆抗体进行放射免疫诊断（radioimmunodiagnosis， RID）和放射免疫治疗（radioimmunotherapy， RIT）是重要的研究方向。曲妥珠单抗（Trastuzumab）是一种靶向HER2的人源化单克隆抗体，是理想的载体分子。为了构建用于诊疗一体（theranostics）的“配对”放射性药物，需要研究不同的放射性核素及其相应的螯合剂对最终放射免疫偶联物（radioimmunoconjugate， RIC）生物学特性的影响。因为放射性金属核素的配位化学特性要求使用特定的双功能螯合剂，而螯合剂和核素的性质可能直接影响RIC的稳定性、药代动力学和靶向效率。本研究的主要目的是探究基于抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗的放射免疫诊疗配对物——[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗和[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗，评估不同螯合剂（DTPA 与 DOTA）和放射性核素（111In 与 177Lu）对这些放射性免疫偶联物生物学特性的影响。

研究的工作流程清晰，主要分为体外研究和体内研究两大部分，每个部分包含若干具体步骤。研究对象主要包括放射性药物本身、SK-BR-3乳腺癌细胞系、正常BALB/c小鼠以及携带SK-BR-3肿瘤的BALB/c裸鼠。体外研究旨在评估RIC的基本性质，而体内研究则旨在评估其在生物系统中的行为。

研究的第一步是免疫偶联与放射免疫标记。研究人员使用商品化曲妥珠单抗，首先通过超滤离心法进行纯化，然后在pH 8.5的碳酸氢钠缓冲液中，以抗体:螯合剂摩尔比为1:20的比例，分别与两种双功能螯合剂P-SCN-Bn-DTPA和DOTA-NHS-ester在37°C下反应2小时，生成免疫偶联物DTPA-曲妥珠单抗和DOTA-曲妥珠单抗。随后，使用PD-10分子排阻柱纯化免疫偶联物。接着，将纯化后的免疫偶联物分别在pH 6.5的醋酸铵缓冲液中，与[111In]InCl3（针对DTPA偶联物）和[177Lu]LuCl3（针对DOTA偶联物）于42°C下孵育1小时进行放射标记。标记后，使用快速薄层色谱法以0.1 M柠檬酸钠缓冲液（pH 5.0）为展开剂测定放射化学纯度。若纯度低于90%，则再次使用PD-10柱进行纯化直至达到要求。该过程未涉及全新的实验方法，但严格遵循并优化了实验室已有的标记和纯化流程。

第二步，进行了一系列体外评估。首先，评估RIC在血清中的稳定性。将两种RIC分别与血清在37°C下共孵育，时间点设定为4、24、48、72、96、120、144和168小时。在每个时间点取样，通过上述快速薄层色谱法测定未分解的RIC百分比，以此评估其在生理环境下的稳定性。其次，测定免疫反应性分数。使用HER2阳性的SK-BR-3乳腺癌细胞系，将细胞悬液进行系列稀释（5.0 × 10^6 至 0.156 × 10^6 细胞/瓶）。分别设置总结合组（加入RIC）、特异性结合组（加入过量未标记曲妥珠单抗竞争）和非特异性结合组。孵育后离心分离细胞和上清，用γ计数器测量放射性，通过林德莫（Lindmo）双倒数作图法计算免疫反应性分数。第三，评估RIC的内化。将SK-BR-3细胞与两种RIC在37°C下孵育1、4和24小时。孵育后，首先使用低pH（2.8）的醋酸缓冲液处理细胞，以去除细胞表面受体结合的（但未内化的）抗体，然后离心分离。测量细胞沉淀（内化部分）和酸性洗脱液（表面结合部分）的放射性，计算内化百分比。以上实验每个数据点通常有3-4个重复样本。

第三步，开展了体内研究。首先是药代动力学研究。在正常雌性BALB/c小鼠（每组4-5只）尾静脉注射两种RIC后，于0、4、24、48、72、96、144和168小时通过眶后丛采集血样，测量血液放射性浓度随时间的变化。数据采用二室模型进行拟合，计算分布半衰期、消除半衰期、清除率、分布容积和有效半衰期等药代动力学参数。其次，建立异种移植乳腺癌动物模型。在雌性BALB/c裸鼠右侧腹股沟区皮下接种SK-BR-3细胞（5 × 10^6个细胞，混于基质胶/DMEM培养基中）。约21天后，当肿瘤体积达到约196 mm³时，用于后续研究。并对肿瘤组织进行了苏木精-伊红染色组织病理学分析以确认肿瘤性质。第三，进行离体生物分布研究。分别在正常BALB/c小鼠和SK-BR-3荷瘤BALB/c裸鼠中（每个时间点每组4-5只动物）进行。尾静脉注射RIC后，于特定时间点（正常小鼠：4, 24, 48, 72, 96, 168小时；荷瘤鼠：24, 72, 168小时）处死动物，收集主要器官和组织（血液、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、肠、骨、脑、胰腺、胃、肌肉以及肿瘤等），称重并测量放射性。计算每克组织注射剂量百分比（%ID/g）以及肿瘤与对侧肌肉的靶向与非靶向比率。第四，基于正常小鼠的生物分布数据，采用医学内照射剂量（Medical Internal Radiation Dose, MIRD）方法，并结合OLINDA/EXM软件和ICRP参考数据，进行了剂量学估算，推算了RIC在人体主要器官中的吸收剂量。

研究的主要结果丰富且具有说服力。在免疫偶联与标记方面，两种RIC均成功制备，放射化学纯度大于90%。其中，[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗的初始标记产率约为84%，需经过PD-10柱纯化才能达到要求纯度，而[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗则无需此步骤，这可能暗示了不同螯合体系的标记效率存在差异。

在体外稳定性实验中，结果明确显示了螯合剂的影响。[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗在血清中表现出极高的稳定性，在168小时内放射化学纯度始终保持在94%以上，且随时间无明显下降。相比之下，[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗的稳定性较差，168小时后纯度降至约75%，尤其是在最初的4小时内下降较快。这归因于DOTA作为大环螯合剂，与177Lu形成的复合物具有更高的动力学和热力学稳定性；而111In可能从线性的DTPA螯合剂中发生轻微的转螯合，与血清中的转铁蛋白等蛋白质结合。

在免疫反应性和内化方面，结果显示了令人惊喜的一致性。两种RIC都保留了极高的免疫反应性，[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗为97%，[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗为98%，表明偶联和标记过程没有破坏抗体与HER2抗原结合的关键区域。当加入过量未标记曲妥珠单抗竞争时，两种RIC与细胞的结合均显著降低，证明了结合的特异性。在内化实验中，两种RIC均随时间推移而被细胞内化，24小时内化率分别达到38.4%和32.4%，且两者在任何时间点均无统计学显著差异。这些结果表明，尽管螯合剂和核素不同，但它们并未影响曲妥珠单抗与靶细胞的特异性结合以及随后的内化过程。这为将它们作为诊疗配对物使用提供了重要前提，因为诊断和治疗剂需要具有相同的靶向生物学行为。

体内药代动力学结果揭示了显著差异。[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗的血浆清除更慢（清除率0.04 mL/h），分布容积更小（0.001 L），有效半衰期更长（144.78小时），几乎是[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗（62.42小时）的两倍。这说明DOTA-177Lu偶联物在血液循环中存留时间更长，从系统中清除的速度更慢。

生物分布结果进一步印证并扩展了上述发现。两种RIC在正常小鼠中均表现出缓慢的血液清除，并在肝脏、脾脏和肾脏中有显著摄取，这与单克隆抗体主要通过网状内皮系统代谢和肾脏排泄的途径一致。一个关键区别在于骨骼摄取：[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗在骨骼中的摄取较高，且随时间增加，这很可能与111In从较不稳定的DTPA复合物中解离，并以游离形式沉积在骨骼中有关。而[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗的骨骼摄取显著较低，这归功于DOTA-177Lu复合物的高稳定性。在荷瘤小鼠模型中，两种RIC均在肿瘤中有显著且随时间增加的摄取，证明了其靶向HER2阳性肿瘤的能力。[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗在肿瘤中的摄取从24小时的2.02% ID/g增加到168小时的4.92% ID/g，而[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗则从1.02% ID/g增加到6.94% ID/g。尽管两者都有效靶向肿瘤，但[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗在72小时和168小时显示出更高的肿瘤/肌肉靶本比，这可能与其更长的血液循环时间有关，允许更多的抗体在肿瘤部位积累。

剂量学估算结果显示，两种RIC在人体器官中的吸收剂量模式不同。对于治疗剂量的[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗，肾脏吸收剂量最高（0.920 mGy/MBq），其次是肝脏（0.690 mGy/MBq）。而对于诊断剂量的[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗，肝脏吸收剂量最高（0.737 mGy/MBq），其次是脾脏（0.444 mGy/MBq）和肾脏（0.330 mGy/MBq）。红骨髓的剂量均较低。

本研究得出的结论是：螯合剂和放射性核素的性质会影响基于曲妥珠单抗的放射免疫偶联物的生物学特性。具体而言，它们虽然不影响抗体的免疫反应性和内化能力，但显著影响RIC在血清中的稳定性、药代动力学特征、生物分布模式以及剂量学分布。研究证实，[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗和[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗构成了一个有前景的放射免疫诊疗配对物。其中，[111In]In-DTPA-曲妥珠单抗适用于单光子发射计算机断层扫描（SPECT）成像诊断，最佳成像时间窗口在给药后72至168小时；而[177Lu]Lu-DOTA-曲妥珠单抗因其高稳定性、良好的肿瘤靶向性和合适的β射线能量，适用于靶向放射免疫治疗。这种配对符合个性化医疗的理念：先用诊断性RIC确认患者肿瘤的HER2表达状态，再对阳性患者施用治疗性RIC，并可利用诊断剂监测治疗反应。

本研究的科学价值在于，它通过系统的比较研究，实证了在开发放射性诊疗配对物时，除了关注抗体本身，还必须充分考虑螯合剂-核素组合对最终药物体内外行为的关键影响。这为合理设计和优化此类放射性药物提供了重要的实验依据和指导原则。其应用价值在于推进了针对HER2阳性乳腺癌的诊疗一体化策略，为临床转化提供了候选药物对。

本研究的亮点包括：首先，研究设计系统且全面，从体外稳定性、结合特性到体内药代、分布和剂量估算，完整评估了诊疗配对物的关键参数。其次，研究明确区分了螯合剂和核素各自（或协同）产生的影响，例如，免疫反应性不受影响而稳定性受显著影响，这加深了对放射性免疫偶联物构效关系的理解。第三，研究不仅证明了两种RIC作为配对物的可行性，还通过生物分布和剂量学数据，为后续临床研究中的用药方案（如成像时间、剂量估算）提供了具体参考。最后，研究成功整合了化学、细胞生物学、动物实验和理论剂量计算等多个学科的方法，体现了转化医学研究的特色。