一、研究作者、机构与发表信息
本研究由浙江大学医学院附属邵逸夫医院结直肠外科的陈佳新、王慧娟、徐建斌等人共同完成，并得到了浙江大学医学院生物治疗重点实验室、国家呼吸疾病区域医疗中心、暨南大学再生医学教育部重点实验室等机构的支持。通讯作者为浙江大学医学院附属邵逸夫医院的宋章法教授。该研究成果以研究论文形式，于2024年9月在线发表于《Science China Life Sciences》期刊上。
二、学术背景与研究目的
该研究属于肿瘤学，特别是结直肠癌分子机制与治疗领域。尽管结直肠癌是全世界范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，但其晚期诊断比例依然很高，转移和复发是导致死亡的主要原因。因此，深入揭示结直肠癌发生发展的分子机制，对于寻找新的诊断标志物和治疗靶点至关重要。
环状RNA是一类具有闭合环状结构的非编码RNA，其异常表达与多种癌症密切相关。它们通过充当微小RNA海绵、与RNA结合蛋白相互作用等多种机制，在肿瘤增殖、转移、免疫调节及肿瘤微环境重塑中发挥关键作用。值得注意的是，环状RNA在血清外泌体中含量丰富且稳定，使其有望成为非侵入性液体活检的潜在生物标志物。然而，对于其在结直肠癌中的具体功能、调控机制及临床转化潜力，仍需进一步探索。
本研究旨在：1）鉴定并验证一个在结直肠癌中具有诊断和预后价值的环状RNA标志物；2）深入探究该环状RNA在结直肠癌中的致癌功能及其分子机制；3）评估其作为治疗靶点的可行性，并尝试开发一种靶向递送系统用于干预治疗。
三、详细研究流程
1. 标志物鉴定与临床关联性分析 首先，研究人员对公开的GSE126094芯片数据（包含10对结直肠癌与癌旁组织）进行生物信息学分析，发现环状RNA hsa_circ_0072088（源自ZFR基因，命名为circZFR）在癌组织中表达上调最显著。同时，他们通过cRNA芯片分析了3例转移性结直肠癌患者与3例非转移性结直肠癌患者外周血清外泌体中的环状RNA，发现circZFR在转移性患者的外泌体中同样高表达。这些交叉分析提示circZFR可能与结直肠癌进展和转移相关。
随后，研究团队收集了83对结直肠癌患者的肿瘤组织和匹配的癌旁组织进行验证。定量PCR结果显示，在83例中，有72例肿瘤组织中circZFR表达高于癌旁组织。数字PCR在10对组织中的验证也证实了这一趋势。更重要的是，circZFR在肿瘤组织中的表达水平与TNM分期呈正相关，且在包含180对样本的组织芯片中，高表达circZFR与患者较短的总生存期、淋巴结转移和远处转移风险增加显著相关。通过荧光原位杂交技术明确circZFR主要定位于肿瘤上皮细胞的细胞质中。
在液体活检方面，研究人员检测了83例结直肠癌患者和83例健康对照者的血清样本，发现癌患者血清中circZFR水平显著升高。ROC曲线分析显示，血清circZFR区分结直肠癌患者与健康人群的曲线下面积达到0.855，具有较高的诊断价值。此外，血清circZFR水平也与肿瘤的晚期分期和远处转移密切相关。
2. 环状RNA特性验证与功能表型研究 通过Sanger测序确认了circZFR的反向剪接连接点。其环状结构通过以下实验得到证实：使用针对反向剪接连接点的发散引物可在cDNA中扩增出circZFR，但无法从基因组DNA中扩增出；circZFR比其线性同源分子linZFR更能抵抗RNase R消化和放线菌素D处理，表明其具有环状RNA特有的稳定性。FISH实验也观察到其胞质定位。
为了探究circZFR的功能，研究者在多种结直肠癌细胞系中检测了其表达，并选择高表达的HCT116和colo320细胞进行后续功能增益和功能缺失实验。他们设计了针对circZFR的反义寡核苷酸和短发夹RNA，以及过表达质粒。体外实验结果表明，敲低circZFR能够显著抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，并促进细胞凋亡；而过表达circZFR则产生相反的效果。在机制上，敲低circZFR导致上皮-间质转化标志物E-cadherin表达上调，N-cadherin和MMP9表达下调，同时降低抗凋亡蛋白Bcl-2，升高促凋亡蛋白Bax和一系列caspase蛋白的水平。有趣的是，他们发现过表达circZFR的CRC细胞释放的外泌体（exo-circZFR）也能促进共培养细胞的增殖和迁移，且呈浓度依赖性，这表明circZFR可以通过外泌体在细胞间传递其致癌功能。
3. 体内功能验证 为了在活体水平验证circZFR的功能，研究构建了小鼠模型。皮下成瘤实验显示，与对照组相比，敲低circZFR能显著抑制HCT116细胞在裸鼠体内的肿瘤生长，肿瘤体积和重量减小，且增殖标志物Ki67的表达降低。在肺转移模型中（尾静脉注射），敲低circZFR组小鼠体内的生物发光信号和肺部转移灶明显减少。在肝转移模型中（脾内注射），敲低circZFR同样显著抑制了肝脏转移的发生。肿瘤组织的免疫组化结果与体外实验一致，敲低组表现出E-cadherin表达增加和N-cadherin表达减少。
4. 上游生成机制探究 为探究circZFR如何产生，研究基于TCGA数据库分析发现，与circZFR表达趋势一致的RNA结合蛋白有ESRP1、PTBP1和NUDT21。通过siRNA分别敲低这些蛋白，发现只有敲低ESRP1能显著降低circZFR的表达，而不影响其前体mRNA水平，但线性linZFR的表达增加，提示ESRP1可能促进circZFR的环化生成。临床样本分析显示ESRP1与circZFR表达呈正相关。通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验，证实ESRP1能够结合在pre-ZFR侧翼内含子（而非环化内含子内部）的特定GGT富集序列上。进一步，利用CRISPR/Cas9技术特异性敲除这些ESRP1结合序列，可显著抑制内源性circZFR的生成，同时细胞的增殖和迁移能力受损。当在这些CRISPR编辑的细胞中再过表达circZFR时，受损的表型得到部分恢复。这证明ESRP1通过结合pre-ZFR侧翼内含子区域，促进了circZFR的环化生成。
5. 下游分子机制探索：与蛋白相互作用 为探索circZFR发挥功能的机制，研究人员进行了RNA pull-down结合质谱分析，寻找与circZFR相互作用的蛋白。银染和质谱分析鉴定出多个潜在结合蛋白，其中BCLAF1（Bcl2相关转录因子1）引起了研究者的注意。随后的RNA pull-down和RIP实验均证实circZFR与BCLAF1蛋白直接结合。通过截断体实验，确定了circZFR上与BCLAF1结合的关键区域。进一步研究发现，过表达或敲低circZFR能相应地上调或下调BCLAF1的蛋白水平，但不影响其mRNA水平。这表明circZFR可能通过结合来稳定BCLAF1蛋白。蛋白质稳定性实验（环己酰亚胺处理）表明，circZFR过表达能减缓BCLAF1蛋白的降解。当使用蛋白酶体抑制剂MG132处理时，BCLAF1蛋白水平显著恢复，而溶酶体抑制剂氯喹效果不明显。更重要的是，免疫沉淀实验显示，在circZFR过表达的细胞中，BCLAF1的泛素化水平降低。这些结果共同表明，circZFR通过与BCLAF1结合，竞争性或空间阻碍其与特定E3泛素连接酶的相互作用，从而抑制了BCLAF1通过泛素-蛋白酶体途径的降解，稳定了BCLAF1蛋白，进而促进肿瘤生长和转移。功能回复实验表明，共同过表达BCLAF1可以部分挽救因circZFR敲低导致的细胞增殖和迁移能力下降。
6. 下游分子机制探索：作为miRNA海绵 由于circZFR敲低诱导的细胞凋亡无法完全被BCLAF1过表达所逆转，研究者推测circZFR还存在其他作用机制。鉴于其胞质定位，他们探索了其作为miRNA海绵的可能性。通过生物信息学工具预测并与cRNA芯片结果交叉，筛选出可能与circZFR结合的miRNA，并利用双荧光素酶报告基因系统进行验证，最终确定miR-3127-5p与circZFR存在直接相互作用。RIP实验也证实circZFR能与AGO2蛋白结合，这是miRNA介导的沉默复合体的核心组分。功能上，过表达miR-3127-5p能抑制CRC细胞增殖和迁移，并促进凋亡。细胞荧光原位杂交实验显示circZFR与miR-3127-5p在细胞质中具有共定位。进一步的荧光素酶报告基因实验证实了它们之间的特异性结合位点。功能回复实验表明，共过表达miR-3127-5p能够部分逆转circZFR过表达对细胞增殖和迁移的促进作用。
接下来，为了寻找miR-3127-5p的下游靶基因，研究者对敲低circZFR的细胞进行了RNA-seq，并结合miR-3127-5p的靶基因预测数据库，发现了候选基因RTKN2（Rhotekin 2）。qRT-PCR和Western blot验证表明，circZFR能正向调控RTKN2的表达。临床样本分析显示circZFR与RTKN2表达呈正相关。双荧光素酶报告基因实验证实RTKN2是miR-3127-5p的直接靶标。机制上，circZFR通过海绵吸附miR-3127-5p，解除了miR-3127-5p对RTKN2的抑制作用，从而上调RTKN2的表达。Western blot结果显示，miR-3127-5p抑制剂可以逆转circZFR敲低导致的RTKN2下调，而miR-3127-5p mimics则可以逆转circZFR过表达导致的RTKN2上调。功能上，共过表达RTKN2可以部分恢复因circZFR敲低导致的凋亡相关蛋白（Bcl-2下降，Bax和caspase上升）的改变。值得注意的是，同时过表达BCLAF1和RTKN2可以协同逆转circZFR敲低对转移相关标志物表达的影响。
7. 靶向治疗潜力探索 鉴于circZFR显著的致癌功能，研究者评估了其作为治疗靶点的潜力。为了克服常规siRNA递送效率低、易降解和非靶向效应等局限性，研究团队利用了一种自主研发的纳米递送系统——TCP1-CD-QDs。该系统以量子点为核，通过主客体相互作用连接环糊精和靶向肽TCP1，能够特异性靶向结直肠癌组织。
体外实验表明，装载了靶向circZFR的siRNA的纳米颗粒能有效被CRC细胞内吞，并高效敲低circZFR（不影响linZFR），从而显著抑制细胞增殖和迁移。为了更贴近临床，研究构建了源自III期结直肠癌患者的患者来源异种移植模型。将PDX小鼠分为三组：PBS对照组、胆固醇偶联的游离si-circZFR组、以及TCP1-CD-QDs纳米载体递送si-circZFR组。结果显示，与对照组相比，两个治疗组均能抑制肿瘤生长，且纳米载体组显示出更强的抑瘤效果和更佳的肿瘤组织分化状态。免疫组化显示，治疗组肿瘤中Ki67、BCLAF1和RTKN2的表达均下降。重要的是，对小鼠主要脏器功能和组织的检测表明，该纳米载体系统具有良好的生物安全性，未观察到明显的毒副作用。
四、主要研究结果
本研究获得了一系列相互印证、逻辑递进的结果：1）通过生物信息学和临床样本验证，首次系统证实circZFR在结直肠癌组织和血清外泌体中显著高表达，且其水平与肿瘤分期、转移和不良预后正相关，是潜在的诊断和预后生物标志物。2）体外和体内功能实验证明，circZFR能促进结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭，抑制凋亡，并能通过外泌体介导细胞间通讯。3）机制上，上游由ESRP1蛋白结合侧翼内含子区域促进其环化生成。下游则通过“一石二鸟”的双重机制发挥作用：一方面，circZFR直接结合并稳定BCLAF1蛋白，抑制其泛素化降解；另一方面，circZFR作为miR-3127-5p的分子海绵，解除其对靶基因RTKN2的抑制。BCLAF1和RTKN2分别主要介导了circZFR促进增殖/转移和抑制凋亡的功能。这些机制相互独立又存在协同，共同驱动结直肠癌进展。4）应用上，成功利用自主研发的TCP1-CD-QDs纳米载体递送si-circZFR，在PDX模型中有效抑制了肿瘤生长，验证了circZFR作为治疗靶点的可行性，并展示了一种有前景的靶向递送策略。
五、研究结论与价值
本研究得出结论：circZFR是一个由ESRP1促进生成的致癌性环状RNA，它通过稳定BCLAF1蛋白和调控miR-3127-5p/RTKN2轴，双重驱动结直肠癌的发生发展和转移。circZFR是结直肠癌潜在的血清液体活检标志物和理想的治疗靶点。
其科学价值在于：1）系统揭示了一个新的环状RNA（circZFR）在结直肠癌中的完整调控网络和双重作用机制，丰富了环状RNA在肿瘤中的功能认知。2）阐明了ESRP1调控circRNA生成的一个具体案例，以及环状RNA通过竞争性结合影响蛋白稳定性的新机制。3）为环状RNA作为miRNA海绵的理论提供了严谨的实验证据链（包括共定位、直接结合、功能回复等）。应用价值在于：1） circZFR在血清中的高表达和诊断效能为其转化为临床无创诊断工具提供了依据。2） circZFR作为治疗靶点的有效性在PDX模型中得到验证，为开发靶向环状RNA的抗癌疗法提供了新思路。3） 自主研发的TCP1-CD-QDs纳米递送系统展示了高效、靶向、安全的siRNA递送潜力，具有临床转化的前景。
六、研究亮点
七、其他有价值的内容
研究在讨论部分还就环状RNA领域的一些争议和挑战进行了评述。例如，针对环状RNA作为miRNA海绵的有效性争议，本研究通过展示circZFR与RTKN2的表达量级相当、拥有等量的miRNA响应元件以及提供完整的实验证据链，为海绵功能的成立提供了有力支持。同时，也客观指出了将单个环状RNA作为生物标志物需要更大规模前瞻性研究验证的现状，以及纳米药物和基于外泌体的递送系统各自面临的挑战与前景，体现了研究的深度和客观性。