本研究由河南大学生命科学学院分析测试中心的崔亚鹏、许锐、陈泽元和陈双喜（通信作者）共同完成，研究论文《酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵对金银花浸提液多酚物质的影响》发表于《食品与发酵工业》期刊2022年第48卷第5期。
学术背景与研究目的 该研究属于食品科学、微生物发酵与天然产物化学的交叉领域。金银花作为一种药食同源的传统中药材，富含多酚、黄酮等生物活性物质，具有抗氧化、抗炎等多种生理功能。然而，天然植物中的部分活性成分可能以结合态（如糖苷形式）存在，其生物利用度有待提高。微生物发酵技术被广泛应用于食品加工中，能够转化底物成分、改善风味、并可能通过微生物的酶系作用释放或转化出新的活性物质。先前的研究多集中于单一菌种（如植物乳杆菌或酵母菌）对金银花的发酵，且多关注总成分变化，对具体化合物在发酵过程中的动态变化及其机制探讨不足。特别是利用酿酒酵母与植物乳杆菌进行协同混合发酵对金银花浸提液具体多酚类物质组成及抗氧化活性影响的研究尚少。因此，本研究旨在探究酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵对金银花浸提液多酚类物质组成、含量及抗氧化活性的具体影响，并利用现代分析技术阐明其物质转化规律，为开发高品质的金银花发酵饮品提供理论依据和数据支持。
详细研究流程 本研究流程系统，主要包括发酵液制备、发酵过程监测、成分与活性测定、以及深入的定性与定量分析。
首先，发酵液制备与发酵过程：研究人员将金银花粉末配制成3%的悬浮液，于65℃水浴浸提120分钟，离心取上清液作为基础浸提液。向上清液中添加1%的葡萄糖作为碳源，经90℃短时杀菌后，接种体积分数均为2.5%的实验室保藏酿酒酵母和植物乳杆菌种子液。在32℃、140 rpm的摇床条件下进行为期72小时的混合发酵，获得发酵液。同时设置不接种菌种的相同处理组作为对照组。在发酵过程中，定期取样监测发酵液的pH值和菌体生物量（以OD600表征）。
其次，常规成分与抗氧化活性测定：在发酵的不同时间点（0, 12, 24, 48, 72小时），取样测定总黄酮和总多酚含量。总黄酮含量采用AlCl₃-NaNO₂-NaOH比色法测定，以芦丁计；总多酚含量采用福林酚（Folin-Ciocalteu）比色法测定，以焦性没食子酸计。同时，评估样品的抗氧化能力，采用DPPH自由基清除实验和ABTS阳离子自由基清除实验来测定其自由基清除率，以此表征抗氧化活性的变化。
第三，基于高分辨质谱的组分定性分析：为了深入探究发酵前后物质组成的全局性变化，研究采用了超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术（UHPLC-Q-TOF-MS）对发酵0小时（对照组）和发酵72小时的样品进行非靶向代谢组学分析。样品经0.22 μm滤膜过滤后进样。液相色谱条件采用C18色谱柱，以0.1%甲酸水和甲醇为流动相进行梯度洗脱。质谱在负离子模式下采集数据。获得的数据使用MetaboScape软件进行处理，通过与数据库比对和二级碎片离子解析，对差异代谢物进行鉴定。结果以火山图和热图形式直观展示对照组与发酵组之间含量发生显著变化的化合物。
第四，目标活性成分的精准定量分析：基于定性分析结果，研究进一步选取了金银花中几种关键的活性成分，包括绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草素和木犀草苷，采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（UHPLC-QQQ-MS/MS）在多反应监测（MRM）模式下进行精确定量。该方法灵敏度高、特异性强。研究人员建立了各目标化合物的标准曲线，并在优化的质谱参数（包括碰撞能量和碎裂电压）下，对发酵过程中（0, 24, 48, 72小时）这些化合物的含量变化进行了动态监测。
主要研究结果 研究结果揭示了混合发酵对金银花浸提液化学成分和生物活性的多方面影响。
关于发酵过程与常规成分变化，监测数据显示，发酵组的OD600在24小时内迅速增长并达到稳定，同时pH值在12小时内从4.9急剧下降至3.5，表明菌体生长旺盛并产生了酸性代谢物。而对照组则无显著变化。总黄酮和总多酚含量变化趋势引人注目：对照组在整个过程中轻微下降；而发酵组的总黄酮含量在发酵初期（0-24小时）有所下降，但在24小时后开始持续回升，最终从72.04 mg/g提升至79.07 mg/g，提升率为10%；总多酚含量则呈现持续上升趋势，从47.74 mg/g显著提升至59.37 mg/g，提升率达24.35%。这表明混合发酵过程不仅抑制了成分的降解，更促进了黄酮和多酚类物质总量的增加。
在抗氧化活性方面，发酵显著增强了浸提液的自由基清除能力。DPPH自由基清除率从发酵前的55%提升至发酵后的71%；ABTS阳离子自由基清除率也从59%提升至64%。抗氧化活性的提升与总多酚、总黄酮含量的增加趋势一致，提示发酵后活性成分的增加是抗氧化能力增强的物质基础。
UHPLC-Q-TOF-MS定性分析结果 提供了全局视角。火山图显示，发酵组与对照组之间存在大量差异表达的代谢物。热图分析具体指出，发酵后浸提液中3,5-二咖啡酰奎尼酸、阿魏酰奎尼酸、木犀草素、莽草酸、肉桂酸等物质的含量显著上升（p < 0.05）。同时，一些糖类物质（如葡萄糖、甘露糖）和糖苷类化合物（如木犀草苷、当药苦苷）的含量则显著下降（p < 0.05）。这一结果为后续定量分析指明了方向，并提示发酵过程中可能发生了糖苷水解和酯化等生物转化反应。
UHPLC-QQQ-MS/MS定量分析结果 精准验证并量化了上述变化。关键活性成分绿原酸的含量从26.566 mg/g显著增加至31.338 mg/g，提升了17.96%。此外，咖啡酸和阿魏酸的含量也有所增加。与之形成对比的是，木犀草苷的含量从0.897 mg/g急剧下降至0.063 mg/g，而在发酵中后期检测到了木犀草素的出现。这一结果与定性分析中木犀草苷下降、木犀草素上升的发现完全吻合，强有力地证明了发酵过程中微生物产生的糖苷酶水解了木犀草苷，释放出其苷元木犀草素。绿原酸含量的增加可能与奎尼酸（发酵过程中含量下降）与咖啡酸、阿魏酸等通过酶促反应结合有关。
结论与意义 本研究得出结论，采用酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵金银花浸提液，能够有效提升其总黄酮、总多酚含量及抗氧化活性。发酵过程促进了糖苷类化合物向苷元的转化（如木犀草苷转化为木犀草素），并可能通过微生物的代谢作用合成了如绿原酸等酯类化合物。这些转化使得活性成分的分子量减小、极性发生变化，可能更易于被人体吸收利用。
该研究的科学价值在于，首次系统阐明了酿酒酵母与植物乳杆菌混合发酵对金银花浸提液中多酚类物质的具体转化路径与规律，从化合物分子层面揭示了发酵提升金银花浸提液品质的机理，而不仅仅是停留在总成分变化的描述。其应用价值在于为开发具有更高抗氧化活性和功能成分生物利用度的金银花发酵饮料或功能性食品提供了坚实的理论依据和可行的工艺方向。
研究亮点 本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，在研究策略上，采用了“混合菌种发酵”，利用了酵母菌和乳酸菌可能存在的协同作用，相较于单一菌种发酵可能带来更复杂的代谢转化和更优的效果。其次，在分析技术上，结合了非靶向代谢组学（UHPLC-Q-TOF-MS）和靶向精准定量（UHPLC-QQQ-MS/MS）两种先进技术，实现了从全局发现到精准验证的完整证据链，使研究结论非常可靠。第三，在研究深度上，不仅关注了总成分和活性的变化，更深入追踪了具体关键活性成分（如绿原酸、木犀草苷/素）在发酵过程中的动态转化，揭示了糖苷水解和可能的酯化合成等具体生物转化机制，对机理的探讨更为深入。最后，研究目标明确指向提升药食两用资源——金银花的附加值，具有明确的产业应用前景。
其他有价值的内容 研究中还观察到一些二元酸（如十四烷二酸、壬二酸）的含量在发酵后有所提升，这些物质可能由微生物代谢产生，其对风味或功能的潜在贡献值得后续探索。此外，发酵初期（12小时）ABTS自由基清除率短暂低于对照组，这可能与发酵初期微生物生长消耗了部分抗氧化物质或产生了某些中间产物有关，这一动态细节提示发酵工艺的优化（如发酵终点控制）可能需要综合考虑不同时间点的活性变化。论文中提供的详细实验方法、标准曲线和质谱参数也为同行重复和借鉴该研究提供了便利。