（由于文本内容主要是《Cell Reports》期刊上发表的一篇题为“Tumor metabolite lactate promotes tumorigenesis by modulating moesin lactylation and enhancing TGF-β signaling in regulatory T cells”的研究论文，因此应按照类型a的格式进行撰写。）

乳酸：肿瘤免疫逃逸的新“帮凶”——《Cell Reports》揭示乳酸通过乳酸化修饰调控调节性T细胞的新机制

一、 研究团队与发表信息

本研究主要由Jian Gu, Jinren Zhou, Qiuyang Chen等学者完成，第一作者和共同第一作者还包括Xiaozhang Xu, Ji Gao等人，通讯作者为Ling Lu。所有作者均来自南京医科大学第一附属医院肝胆中心、中国医学科学院肝脏移植与移植免疫学研究单元、南京医科大学江苏省恶性肿瘤生物标志物与防治重点实验室及癌症个体化治疗协同创新中心。这项原创性研究成果于2022年6月21日发表在知名学术期刊Cell Reports（第39卷，文章编号110986）上。论文发表后，于2022年7月19日因图表问题发布了一则更正声明。

二、 学术背景与研究目的

本研究的核心科学领域是肿瘤免疫学和肿瘤代谢。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）是一个复杂的生态系统，其中代谢重编程是肿瘤细胞的核心特征之一。著名的“瓦博格效应”（Warburg Effect）指出，即使在有氧条件下，肿瘤细胞也倾向于进行糖酵解，产生大量乳酸，导致肿瘤组织内乳酸浓度远高于正常组织。长期以来，乳酸被视为代谢废物。然而，近年研究发现，乳酸可作为信号分子和能量底物，影响肿瘤进展、转移和免疫应答。在免疫方面，调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg cells）是维持肿瘤免疫抑制微环境的关键细胞，它们高表达转录因子Foxp3，通过多种机制抑制效应T细胞的抗肿瘤功能。已有研究表明，Treg细胞在低葡萄糖、高乳酸的TME中具有代谢优势，但乳酸具体如何精确调控Treg细胞的功能和分化，其分子机制尚不明确。

与此同时，一种新型的蛋白质翻译后修饰——赖氨酸乳酸化（Lysine Lactylation, Kla）被报道，它由乳酸直接供能，在组蛋白上发挥基因调控作用。这提示，乳酸可能通过这种非代谢方式影响细胞功能。此外，已有文献报道膜组织蛋白Moesin通过调控转化生长因子-β（Transforming Growth Factor-β, TGF-β）受体II型（TGF-βRII）的膜表达，影响Treg细胞的分化。

基于以上背景，本研究旨在深入探究：1）肿瘤代谢物乳酸对Treg细胞的分化、稳定性和功能有何具体影响？2）乳酸是否通过乳酸化修饰来调控Treg细胞？3）如果存在乳酸化修饰，其关键的靶蛋白和作用位点是什么？4）该修饰如何影响下游信号通路，最终促进肿瘤发生？回答这些问题，有望揭示肿瘤代谢与免疫抑制之间一条全新的桥梁，为癌症免疫治疗提供新的潜在靶点。

三、 详细研究流程

本研究采用了从体外到体内、从机制探索到临床关联的多层次、系统性研究策略，流程严谨而复杂。

第一阶段：体外验证乳酸对Treg细胞的影响。 研究首先从C57BL/6小鼠脾脏中分选初始CD4+ T细胞，在TGF-β和IL-2存在下诱导外周来源的调节性T细胞（pTreg）。同时，在培养体系中分别添加多种肿瘤微环境常见代谢物（嘧啶、嘌呤、乙酰基团）以及不同浓度（10 mM, 20 mM）的乳酸。通过流式细胞术检测Foxp3（Treg细胞关键标志物）和CTLA-4（免疫检查点分子）的表达水平，评估乳酸对Treg细胞分化的影响。为了评估功能，研究者进行了CFSE抑制实验：将经过乳酸或磷酸盐缓冲液（PBS）处理的Treg细胞与CFSE标记的CD3+ T细胞共培养，通过检测后者增殖被抑制的程度来量化Treg细胞的免疫抑制能力。此外，还利用海马分析仪（Seahorse Analyzer）测量了细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），以分析乳酸是否改变了Treg细胞的代谢模式（偏向有氧氧化还是糖酵解）。为了模拟炎症环境，研究者在诱导体系中加入了炎症因子IL-1β和IL-6，观察乳酸能否维持Treg细胞在不利条件下的稳定性和功能（Foxp3、TGF-β、IL-10表达及抑制能力）。

第二阶段：探究乳酸的作用是否依赖乳酸化修饰。 研究团队检测了乳酸处理后Treg细胞内整体蛋白质乳酸化水平的变化。由于难以获得足量小鼠Treg细胞进行质谱分析，他们创新性地利用公共STRING数据库，以“CD4”、“CD25”、“Foxp3”为关键词，筛选出可能与免疫相关的、已知存在乳酸化修饰的蛋白质及其位点，最终选择了四个候选位点：DDX58蛋白的K851、IDO蛋白的K363、HMGB1蛋白的K114以及Moesin蛋白的K72。随后，他们与景杰生物合作，针对这四个位点的乳酸化修饰，定制了特异性的抗体（定制抗体是本研究的一个关键技术手段）。在Treg细胞诱导体系中，分别加入这些定制抗体，观察哪个抗体能阻断乳酸对Foxp3表达的促进作用。结果发现，只有针对Moesin蛋白第72位赖氨酸乳酸化（l-Moesin）的抗体能显著逆转乳酸的效果。这初步将乳酸的作用锚定在Moesin蛋白的K72位点乳酸化上。

第三阶段：阐明乳酸化修饰-Moesin-TGF-β信号轴的具体机制。 首先，通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）证实，乳酸处理增加了Moesin蛋白K72位点的乳酸化水平，但并不改变Moesin蛋白本身以及TGF-β受体I型（TGF-βRI）和II型（TGF-βRII）的总蛋白量。接着，研究通过分子对接（Molecular Docking）进行三维建模，预测了Moesin蛋白在K72位点乳酸化前后与TGF-βRI和TGF-βRII的相互作用变化。模型显示，乳酸化后的K72能与TGF-βRI形成一个额外的氢键，从而增强两者结合；而该位点位于与TGF-βRII相互作用的另一侧，因此不影响其结合。这一预测通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验得到验证：乳酸处理后，与TGF-βRI结合的l-Moesin显著增多。下游信号检测表明，乳酸处理增强了TGF-β信号通路关键分子Smad3的磷酸化，而加入l-Moesin抗体则消除了这种增强效应。最后，使用TGF-βRI特异性抑制剂SB-431542和TGF-βRII特异性抑制剂ITD-1进行功能挽救实验，证实乳酸促进Treg分化的作用依赖于TGF-βRI，而非TGF-βRII。

第四阶段：体内动物模型验证。 研究建立了小鼠肝癌细胞系Hepa1-6皮下移植瘤模型。为了验证乳酸的作用，一组小鼠注射乳酸脱氢酶抑制剂（LDHi）以降低肿瘤内乳酸水平；另一组注射l-Moesin抗体以阻断Moesin乳酸化功能；对照组注射生理盐水。定期测量肿瘤体积，并取瘤分析。结果显示，LDHi和l-Moesin抗体治疗均能显著抑制肿瘤生长。肿瘤组织学分析显示，治疗组肿瘤内Foxp3+ Treg细胞浸润减少，而干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎因子表达增加，表明抗肿瘤免疫应答增强。作为对照，在缺乏T、B细胞的Rag1基因敲除（KO）小鼠中，LDHi则失去了抗肿瘤效果，证明其作用依赖于免疫系统。此外，研究还探索了联合疗法的潜力，发现抗PD-1抗体联合LDHi治疗，比单独使用抗PD-1具有更强的抑瘤效果，且肿瘤内Foxp3表达更低。

第五阶段：临床样本关联分析。 为了将基础研究发现与临床联系起来，研究者收集了接受抗PD-1联合阿帕替尼治疗后进行手术的肝细胞癌（HCC）患者的肿瘤样本。根据治疗效果将患者分为应答组（PD-1-e）和非应答组（PD-1-i）。检测发现，应答组患者肿瘤组织中的乳酸浓度以及Treg细胞内Moesin的乳酸化水平和p-Smad3水平，均低于非应答者。这为机制的临床相关性提供了初步证据。

数据整合与分析：所有体外实验均设置生物学重复（通常n=3），数据以均值±标准差表示，使用GraphPad Prism软件进行学生t检验、单因素或双因素方差分析，以p<0.05为具有统计学显著性。

四、 主要研究结果

1. 乳酸增强Treg细胞的分化、稳定性和功能：体外实验明确显示，10 mM乳酸能显著提高诱导的pTreg细胞中Foxp3和CTLA-4的表达，并增强其抑制CD3+ T细胞增殖的能力。即使在加入IL-1β和IL-6的炎症环境下，乳酸处理组Treg细胞的Foxp3表达下降幅度更小，且能更好地维持免疫抑制因子TGF-β和IL-10的分泌以及抑制功能。代谢分析表明，乳酸使Treg细胞的代谢从糖酵解转向有氧氧化（OCR升高，ECAR降低）。
2. 乳酸通过Moesin蛋白K72位点的乳酸化发挥作用：乳酸处理提高了Treg细胞内整体蛋白质乳酸化水平。在四种定制抗体中，唯有抗l-Moesin (K72)抗体能够有效阻断乳酸对Foxp3表达的促进作用，并逆转乳酸带来的代谢转换（OCR下降，ECAR回升）和增强的抑制功能。这直接证明了Moesin的K72位点乳酸化是乳酸调控Treg细胞的核心事件。
3. Moesin乳酸化增强TGF-βRI信号通路：机制研究表明，乳酸并不改变Moesin和TGF-β受体的蛋白量，但通过促进Moesin在K72位点的乳酸化，增强了Moesin与TGF-βRI（而非TGF-βRII）的相互作用。这进一步强化了下游Smad3的磷酸化激活。使用TGF-βRI抑制剂可完全消除乳酸对Treg分化的促进作用，而TGF-βRII抑制剂则无此效果，清晰地勾勒出“乳酸 → Moesin K72乳酸化 → 与TGF-βRI结合增强 → Smad3磷酸化增强 → Foxp3表达上调 → Treg功能增强”的信号传导轴。
4. 靶向乳酸-Moesin轴具有抗肿瘤效果：体内实验证实，通过LDHi降低肿瘤乳酸水平，或通过注射l-Moesin抗体直接阻断Moesin乳酸化的功能，都能有效抑制小鼠肿瘤生长，并伴随肿瘤内Treg细胞减少和效应免疫反应增强。联合使用LDHi和抗PD-1抗体，产生了协同抗肿瘤效应。
5. 临床样本提示转化潜力：对肝癌患者样本的分析发现，对抗PD-1治疗应答良好的患者，其肿瘤内乳酸水平和Treg细胞中Moesin乳酸化水平较低。这初步提示，肿瘤乳酸代谢和Moesin乳酸化状态可能与免疫治疗疗效相关，有望作为预测生物标志物或治疗靶点。

五、 研究结论与价值

本研究得出核心结论：肿瘤代谢物乳酸并非简单的废物，它通过诱导Moesin蛋白第72位赖氨酸发生乳酸化修饰，增强Moesin与TGF-βRI的相互作用，从而放大TGF-β/Smad3信号通路，最终促进调节性T细胞的分化、稳定性和免疫抑制功能，协助肿瘤实现免疫逃逸和生长。

其科学价值在于： 1. 建立了代谢-表观遗传/翻译后修饰-免疫调控的新联系：将肿瘤代谢重编程（乳酸积累）与免疫抑制细胞（Treg）的功能通过一种新型蛋白质修饰（乳酸化）直接联系起来，揭示了肿瘤微环境中代谢物调控免疫应答的一种精准分子机制。 2. 拓展了乳酸化修饰的生物学功能：将乳酸化修饰的研究从组蛋白调控基因表达，延伸至非组蛋白调控信号转导和细胞功能，特别是免疫细胞功能，为该领域开辟了新方向。 3. 深化了对Treg细胞在代谢异常微环境中适应性优势的理解：明确了乳酸不仅作为能源底物，更作为信号分子，通过特定分子开关（Moesin乳酸化）重塑Treg细胞的表型和代谢，使其更好地在肿瘤环境中生存并发挥抑制作用。

其应用潜力体现在： 1. 提供新的免疫治疗靶点：Moesin的K72位点乳酸化、乳酸转运体（MCT）或乳酸脱氢酶（LDH）成为潜在的治疗靶标。通过小分子抑制剂或抗体干扰这一轴心，可能解除肿瘤的免疫抑制，增强现有免疫检查点抑制剂（如抗PD-1）的疗效。 2. 提供疗效预测标志物：肿瘤内乳酸水平或Treg细胞中Moesin的乳酸化水平，可能作为预测患者对免疫治疗（尤其是抗PD-1治疗）应答情况的生物标志物。

六、 研究亮点

1. 机制新颖且深入：首次发现并证实了乳酸通过Moesin蛋白的特定位点乳酸化来调控Treg细胞，并完整解析了从乳酸分子到细胞功能增强的清晰信号通路（乳酸 → Moesin Kla → TGF-βRI/Smad3），逻辑链条严密。
2. 研究策略系统全面：结合了体外分子机制探索、体内动物模型验证以及初步临床样本关联，从基础到临床转化，证据充实。
3. 方法学上的创新：在面对难以获取足量Treg细胞进行传统质谱筛选的挑战时，创新性地采用生物信息学筛选加定制特异性抗体的策略，成功锁定关键修饰位点，为解决类似问题提供了思路。
4. 强烈的转化医学意义：研究不仅解释了生物学现象，更直接通过体内实验证明了靶向该通路的抗肿瘤效果，并与临床免疫治疗疗效进行了关联，为开发新的联合疗法提供了坚实的理论基础。

七、 其他

研究在讨论部分也坦诚了其局限性，例如因技术限制未能用质谱全面筛选Treg细胞中所有乳酸化位点，可能遗漏其他重要靶点；未能构建Moesin条件性敲除小鼠或K72位点突变小鼠进行更确凿的在体验证。这些为后续更深入的研究指明了方向。总体而言，这项研究是肿瘤代谢免疫学领域的一项重要进展，为理解肿瘤如何巧妙利用自身代谢产物塑造免疫抑制微环境提供了全新视角，具有重要的理论和应用价值。