针对黑色素瘤细胞适应天冬酰胺限制的MAPK信号通路调控c-Myc机制的研究报告

本文报告了由Gaurav Pathria*†、Sachin Verma、Jun Yin、David A. Scott与Ze’ev A. Ronai**共同完成的一项原创性研究，该研究成果以《MAPK signaling regulates c-Myc for melanoma cell adaptation to asparagine restriction》为题，发表于2021年2月的《EMBO Reports》期刊（第22卷，文章编号e51436）。第一作者兼共同通讯作者Gaurav Pathria在开展研究时隶属于美国拉霍亚的Sanford Burnham Prebys医学发现研究所癌症中心（现任职于Genentech公司），资深通讯作者Ze’ev A. Ronai同属该研究所。

一、 学术背景与研究目标 本研究属于癌症生物学与代谢调控领域。癌症细胞因其高速增殖的特性，对营养供应有极高的依赖性。氨基酸限制疗法作为潜在的癌症治疗策略之一，旨在切断肿瘤的“粮草”。然而，癌细胞进化出多种抵抗机制，阻碍了此类疗法的临床转化。其中，天冬酰胺是研究较为深入的靶点，治疗急性淋巴细胞白血病的药物L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）即通过水解天冬酰胺发挥作用。但一些实体瘤，如黑色素瘤和胰腺癌，虽然也低表达天冬酰胺合成酶（ASNS），却对L-天冬酰胺酶反应不佳，这表明存在未知的耐药机制。

此前，该研究团队发现，在天冬酰胺限制条件下，黑色素瘤细胞中MAPK信号通路被激活，并对于激活转录因子4（Activating Transcription Factor 4, ATF4）的诱导及其靶基因ASNS的表达至关重要，从而介导了对治疗的抵抗。ATF4是细胞应对氨基酸限制（称为氨基酸反应，Amino Acid Response, AAR）的核心转录因子，它调控一系列基因的表达，帮助细胞适应营养压力。然而，调控AAR信号通路上游的详细机制，特别是生长因子信号如何与营养感知信号交叉对话，尚不完全清楚。c-Myc是一个关键的原癌基因转录因子，参与调控细胞生长、增殖和代谢，也是MAPK信号通路的下游效应分子。基于此，本研究旨在探究在天冬酰胺限制的背景下，c-Myc是否以及如何被调控，并阐明其在黑色素瘤细胞适应这种营养压力过程中的生理功能和分子机制。

二、 详细研究流程 本研究采用分子细胞生物学和代谢组学相结合的方法，流程严谨，层层递进，主要包含以下几个核心部分：

1. 探究天冬酰胺限制对c-Myc表达的影响：

   • 研究对象与处理：研究使用了两株人黑色素瘤细胞系A375和UACC-903作为模型。为模拟天冬酰胺限制，研究采用小干扰RNA（siRNA）敲低内源性天冬酰胺合成酶（ASNS）的表达，而非简单地从培养基中去除天冬酰胺，这更接近肿瘤微环境中酶表达不足的病理状态。
   • 实验方法：通过蛋白质免疫印迹（Immunoblotting）检测c-Myc和ATF4的蛋白水平变化；通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测ATF4靶基因（如PSAT1、GPT2、SLC1A5、SLC7A5等）以及已知的c-Myc靶基因（如GLS、LDHA、GLUT1等）的mRNA表达水平；通过细胞计数评估增殖能力。
   • 数据处理：蛋白条带进行灰度值分析，mRNA数据以相对于对照的倍数变化表示，增殖数据绘制生长曲线。统计分析采用非配对t检验（两组比较）或双向方差分析（多时间点比较）。

2. 揭示MAPK-GSK3-β信号轴对c-Myc的调控机制：

   • 研究对象与处理：在A375细胞中进行ASNS敲低，并联合使用多种抑制剂或表达突变体。关键实验处理包括：使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（Cycloheximide）处理不同时间点，追踪c-Myc蛋白稳定性；使用BRAF抑制剂PLX-4032或ERK抑制剂SCH772984抑制MAPK信号；使用1-氮杂肯帕罗酮（1-azakenpaullone）抑制GSK3-β活性。
   • 实验方法：蛋白质免疫印迹检测c-Myc、磷酸化及总GSK3-β（Ser-9位点磷酸化代表失活）、磷酸化及总ERK1/2、磷酸化及总Akt等蛋白水平。通过转染非磷酸化（S9A，持续激活）或激酶死亡（K85A）的GSK3-β突变体质粒，功能性地验证GSK3-β的作用。
   • 数据处理：通过比较不同处理条件下c-Myc蛋白的半衰期、磷酸化蛋白水平的变化，来论证调控关系。

3. 阐明c-Myc对ATF4诱导及氨基酸反应信号的关键作用：

   • 研究对象与处理：在A375和UACC-903细胞中，同时敲低ASNS和c-Myc（或表达GSK3-β S9A突变体），或联合使用MAPK抑制剂。
   • 实验方法：蛋白质免疫印迹和RT-qPCR检测ATF4及其靶基因的表达变化。细胞计数实验评估联合干预对增殖的抑制效果。
   • 数据处理：通过对比单一敲低ASNS与联合干预后ATF4信号通路活性的差异，判断c-Myc在该通路中的必要性。

4. 解析c-Myc通过促进必需氨基酸摄取和维持mTORC1活性来支持AAR信号的分子通路：

   • 研究对象与处理：本研究聚焦于c-Myc的两个转录靶点——氨基酸转运蛋白SLC1A5（谷氨酰胺转运蛋白）和SLC7A5（与SLC3A2形成异二聚体，负责大分子中性氨基酸/必需氨基酸转运）。通过siRNA分别敲低SLC1A5、SLC7A5或其伴侣蛋白SLC3A2。同时，使用SLC7A5的小分子抑制剂BCH进行化学抑制。此外，还进行了拯救实验，即在敲低c-Myc的同时过表达SLC7A5。
   • 实验方法：
     • 蛋白质与基因表达分析：检测上述转运蛋白的表达，以及mTORC1活性的经典标志物——磷酸化的p70 S6激酶（Thr389）和核糖体S6蛋白（Ser235/236）。
     • 代谢组学分析：采用气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS）技术，定量分析A375细胞在ASNS敲低、联合敲低ATF4、c-Myc、SLC1A5或SLC7A5后，细胞内所有氨基酸的水平变化。这是本研究的一个关键实验，提供了直接的代谢物数据支持。
     • 功能验证：细胞增殖实验。
   • 数据处理：GC-MS数据以热图或柱状图形式展示各氨基酸浓度的倍数变化，并与遗传或药物干预的结果相关联，构建从信号到代谢表型的完整证据链。

三、 主要研究结果 1. 天冬酰胺限制上调c-Myc表达：敲低ASNS成功诱导了ATF4及其靶基因，同时显著上调了c-Myc的蛋白水平及其下游靶基因的表达。补充外源性天冬酰胺或使用L-天冬酰胺酶处理可逆转或模拟这一效应，证实c-Myc的上调确实由天冬酰胺限制本身引起，而非siRNA的脱靶效应。

1. MAPK-GSK3-β信号轴介导c-Myc的稳定：机制研究表明，ASNS敲低激活了MAPK（ERK）信号，但不影响PI3K-Akt信号。激活的MAPK促使GSK3-β在Ser-9位点发生抑制性磷酸化，从而使其失活。GSK3-β的失活减少了对c-Myc Thr-58位点的磷酸化，而该磷酸化是c-Myc被蛋白酶体降解的标志。因此，MAPK信号通过抑制GSK3-β，稳定了c-Myc蛋白。证据包括：ASNS敲低延长了c-Myc的半衰期；MAPK抑制剂可阻断GSK3-β磷酸化和c-Myc的上调；表达持续激活的GSK3-β（S9A）突变体可完全阻断c-Myc的诱导；而GSK3-β抑制剂或激酶死亡突变体（K85A）能挽救MAPK抑制导致的c-Myc下调。

2. c-Myc对于ATF4的充分诱导不可或缺：敲低c-Myc或抑制其上游的MAPK-GSK3-β轴，虽不影响ASNS敲低本身，却几乎完全阻断了ATF4蛋白水平的上升及其下游转录程序的激活。表达不能被GSK3-β磷酸化的c-Myc（T58A）突变体，可以逆转由活性GSK3-β表达引起的ATF4抑制。功能上，同时抑制c-Myc或表达活性GSK3-β，与单独天冬酰胺限制相比，能更有效地抑制黑色素瘤细胞的增殖。这表明c-Myc是连接MAPK信号与完整AAR信号通路的关键节点。

3. c-Myc通过上调SLC7A5促进必需氨基酸摄取以维持mTORC1活性和ATF4翻译：这是本研究最核心的机制发现。

   • SLC7A5是关键效应分子：在c-Myc上调的转运蛋白中，敲低SLC7A5（而非SLC1A5）能有效阻断ASNS敲低引起的ATF4诱导及整个AAR转录程序。同样，敲低SLC7A5的伴侣蛋白SLC3A2也产生类似效果。
   • 代谢证据：GC-MS分析显示，ASNS敲低导致细胞内几乎所有氨基酸水平显著升高，这依赖于ATF4和c-Myc。敲低SLC7A5（而非SLC1A5）特异性阻断了这种广泛的氨基酸积累，为SLC7A5在摄取必需氨基酸中的主导作用提供了直接证据。
   • 维持mTORC1活性：ASNS敲低后，mTORC1活性（通过p-p70S6K和p-S6衡量）得以维持。然而，敲低c-Myc、SLC7A5或SLC3A2，或使用SLC7A5抑制剂BCH，均会抑制mTORC1的活性。同时，BCH也抑制了ATF4的诱导。
   • 信号通路闭合：活性GSK3-β（S9A）的表达抑制了c-Myc和SLC7A5的上调，并降低了mTORC1活性。反之，在c-Myc被敲低的细胞中过表达SLC7A5，能够恢复mTORC1活性和ATF4的诱导。功能上，敲低SLC7A5或SLC3A2能协同增强天冬酰胺限制对细胞增殖的抑制。

这些结果环环相扣，逻辑严密地证明：天冬酰胺限制 → 激活MAPK信号 → 抑制GSK3-β → 稳定c-Myc蛋白 → c-Myc转录上调SLC7A5 → 增加必需氨基酸摄取 → 维持mTORC1活性 → 促进ATF4蛋白翻译 → 激活完整的AAR适应性程序 → 细胞存活/增殖。

四、 研究结论与价值 本研究揭示了一条此前未知的癌细胞适应天冬酰胺限制的信号轴：MAPK–GSK3-β–c-Myc–SLC7A5。该轴心通过调控必需氨基酸的摄入和mTORC1活性，来维持ATF4介导的生存信号，从而使黑色素瘤细胞能够在营养压力下存活。这解释了为何某些低表达ASNS的实体瘤对天冬酰胺酶疗法不敏感——因为它们可以通过激活该旁路信号来“绕开”直接的天冬酰胺剥夺。

其科学价值在于： 1. 深化了对AAR信号通路的理解：首次将生长因子信号（MAPK）、癌基因（c-Myc）、代谢转运体（SLC7A5）和营养传感器（mTORC1）系统地整合到氨基酸限制应答的调控网络中，揭示了细胞内部不同信号系统间复杂的交叉对话。 2. 阐明了新的耐药机制：为黑色素瘤等实体瘤抵抗天冬酰胺限制疗法提供了明确的分子机制。 3. 指明了联合治疗新策略：研究提示，同时靶向MAPK信号（如使用BRAF/MEK抑制剂）和天冬酰胺限制，或直接靶向SLC7A5，可能是克服耐药、增强治疗效力的有效策略。这为癌症的代谢治疗提供了新的思路和潜在的药物组合靶点。

五、 研究亮点 1. 机制研究的系统性与深度：从现象（c-Myc上调）出发，逐层深入解析上游调控（MAPK-GSK3-β）、核心功能（对ATF4的必要性）到下游效应器（SLC7A5）及最终代谢后果（氨基酸摄取、mTORC1活性），构成了一个完整、闭合的信号环路，论证非常扎实。 2. 关键技术数据的支持：利用GC-MS进行全氨基酸谱分析，为“SLC7A5介导必需氨基酸摄取”这一核心论点提供了直接、定量的代谢物组学证据，增强了说服力。 3. 严谨的遗传学与药理学验证：不仅使用了siRNA敲低和化学抑制剂，还广泛应用了点突变体（GSK3-β S9A/K85A， c-Myc T58A）和过表达拯救实验，从正反两个方面验证了各分子之间的功能关系。 4. 明确的转化医学意义：研究结论直接指向了可操作的联合治疗策略，将基础研究发现与临床治疗挑战紧密结合。

六、 其他有价值的内容 作者在讨论部分指出，这条MAPK-GSK3-β-c-Myc信号轴可能不仅限于天冬酰胺限制，也可能参与癌细胞对其他氨基酸（如谷氨酰胺、丝氨酸）限制的适应过程，这为后续研究开辟了新的方向。此外，研究还提及在KRAS突变背景下，PI3K-Akt信号也可能参与调控GSK3-β-c-Myc轴，提示了不同癌基因背景下的信号通路异质性。研究构建了一个详细的模型图（文中Figure 5），清晰地概括了AAR信号通路与生长因子信号通路如何协同作用，促进黑色素瘤细胞抵抗天冬酰胺限制，该模型是对全文精华的高度总结。