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研究报告：Tris(2-乙基己基)磷酸酯（TEHP）对人肝细胞的细胞遗传毒性与转录组学影响

1. 研究作者与发表信息

本研究由Quaiser Saquib（通讯作者）、Abdullah M. Al-Salem、Maqsood A. Siddiqui、Sabiha M. Ansari、Xiaowei Zhang和Abdulaziz A. Al-Khedhairy合作完成，作者单位包括沙特阿拉伯国王沙特大学（King Saud University）理学院动物学系、植物与微生物学系，以及中国南京大学环境学院。研究于2022年4月发表在International Journal of Molecular Sciences（影响因子：5.923），标题为《Cyto-Genotoxic and Transcriptomic Alterations in Human Liver Cells by Tris(2-ethylhexyl) Phosphate (TEHP): A Putative Hepatocarcinogen》。

2. 学术背景与研究目标

科学领域：环境毒理学与分子毒理学。
研究动机：
- TEHP是一种广泛使用的有机磷阻燃剂（OPFRs）和增塑剂，常见于塑料制品、家具和电子产品中。近年研究发现，TEHP可通过食物链、室内灰尘等途径进入人体，并在血液、母乳中检出，但其肝毒性和致癌潜力缺乏系统研究。
- 既往关于TEHP的毒理学数据多基于20世纪80年代的动物实验，且人类细胞研究极少。本研究选择人肝癌细胞（HepG2）作为模型，因其分化潜能和基因表达谱与正常人肝细胞相似，是毒理学研究的黄金标准。
研究目标：
1. 评估TEHP对HepG2细胞的细胞毒性、氧化应激和线粒体功能障碍；
2. 解析TEHP诱导的DNA损伤和凋亡机制；
3. 通过转录组学分析揭示TEHP潜在的致癌通路。

3. 研究流程与方法

研究分为以下核心实验流程：

（1）细胞毒性评估
- 对象与处理：HepG2细胞暴露于TEHP（5–400 μM，24–72小时），对照组为未处理细胞。
- 实验方法：
- MTT法：检测线粒体脱氢酶活性，反映细胞存活率。
- 中性红摄取（NRU）法：评估溶酶体膜完整性。
- 关键发现：TEHP在100–400 μM浓度下作用72小时显著降低细胞存活率（MTT：19.68%–58.91%；NRU：29.08%–57.90%），低浓度（<50 μM）无毒性。

（2）氧化应激与线粒体功能检测
- 流式细胞术：定量细胞内活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）、钙离子（Ca²⁺）内流和酯酶活性。
- 染料：DCFH-DA（ROS）、DAF-2DA（NO）、Fluo-3（Ca²⁺）、CFDA-SE（酯酶）、Rh123（线粒体膜电位ΔΨm）。
- 结果：TEHP（100–400 μM）显著升高ROS（187.67%）、NO（134.9%）、Ca²⁺（180.7%）和ΔΨm（170.7%），表明线粒体功能障碍。

（3）DNA损伤分析（彗星实验）
- 方法：单细胞凝胶电泳检测DNA链断裂，计算Olive尾矩（OTM）。
- 结果：TEHP处理组OTM值较对照组增加4.67–13.78倍，且损伤程度呈剂量依赖性。

（4）细胞周期与凋亡分析
- 流式细胞术：PI染色检测细胞周期，Annexin V-PE/7-AAD双染区分凋亡阶段。
- 结果：TEHP导致SubG1期细胞比例升高（23.1%–50.8%），并增加早期凋亡（5.26%–19.80%）和晚期凋亡细胞（1.00%–10.25%）。

（5）凋亡蛋白免疫荧光检测
- 靶点：p53、Caspase-3/9。
- 发现：TEHP激活p53核转位，并增强Caspase-3/9的胞质和核内表达，证实线粒体依赖性凋亡通路。

（6）转录组学分析（RT-qPCR阵列）
- 方法：84个癌症通路基因的qPCR阵列（PAHS-033Z）。
- 结果：TEHP（100 μM）上调10个基因（如GADD45G：45.13倍；PFKL：9.16倍），下调4个基因（如EPO：-3.30倍；MAPK14：-5.26倍），提示TEHP可能通过代谢重编程（如糖酵解增强）和DNA修复抑制促癌。

4. 主要结果与逻辑链条

• 毒性机制：TEHP通过ROS爆发→Ca²⁺超载→ΔΨm崩溃→DNA损伤→p53/Caspase激活→凋亡，形成级联反应。
  
• 致癌潜力：转录组数据表明，TEHP上调的基因（如GADD45G、PFKL）与癌症代谢和增殖相关，而DNA修复基因（ERCC5）下调，支持其作为潜在肝致癌物的假说。
  

5. 研究结论与价值

• 科学意义：首次系统证明TEHP在人类肝细胞中诱导氧化应激、DNA损伤和凋亡，并揭示其通过癌症相关通路（如Warburg效应）促癌的分子机制。
  
• 应用价值：为TEHP的环境风险评估提供实验依据，呼吁对OPFRs类物质进行更严格的监管。
  

6. 研究亮点

1. 多维度毒性解析：结合细胞毒性、基因组学和转录组学，全面评估TEHP的肝毒性。
   
2. 创新方法：使用qPCR阵列筛选癌症通路基因，弥补了既往研究的空白。
   
3. 公共卫生警示：TEHP在常见暴露浓度（如室内灰尘）下即显示显著毒性，需关注长期低剂量暴露风险。
   

7. 其他有价值内容

• 局限性：未检测TEHP代谢产物的毒性，后续需结合原代肝细胞或动物实验验证。
  
• 延伸方向：可探索TEHP与其他OPFRs的联合毒性效应。
  

此研究为理解TEHP的毒理机制提供了重要数据，并为相关政策制定和毒理学研究范式提供了参考。