近日，来自厦门大学、浙江大学、美国德克萨斯大学安德森癌症中心及新加坡分子与细胞生物学研究所等多家研究机构的科学家们在 The Journal of Clinical Investigation 期刊上发表了题为 Sptan1/Numb axis senses cell density to restrain cell growth and oncogenesis through Hippo signaling 的研究论文。该研究首次揭示了一条由细胞膜骨架蛋白 αII-血影蛋白、衔接蛋白 Numb 和激酶 MARK 共同构成的细胞密度感应轴，该轴通过调控核心抑癌信号通路——Hippo通路，在维持组织稳态和抑制癌症发生中扮演了关键角色。这项研究极大地深化了我们对细胞如何感知“拥挤程度”并停止增殖这一基本生命过程的理解，并为癌症治疗提供了新的潜在靶点。
在多细胞生物中，细胞通过感知周围细胞的存在和密度，精确调控自身的增殖行为，从而实现正常的组织形态发生和器官大小控制。当细胞密度增加到一定程度时，细胞之间发生接触，会触发接触抑制效应，迫使增殖中的细胞进入生长停滞状态。这种基于细胞密度的生长调控机制对于防止组织过度生长至关重要。相反，当接触抑制失调时，细胞将失去对增殖的控制，这是多种癌症发生的关键起始步骤。尽管已知细胞连接复合体在接触抑制中发挥重要作用，但其下游调控细胞增殖和癌变的具体分子机制仍不明确。
其中，Hippo通路 被证实是调控细胞接触抑制的核心信号网络。该通路通过一系列激酶级联反应，最终使转录共激活因子YAP/TAZ磷酸化并滞留于细胞质中被降解或失活，从而抑制促增殖基因的表达。在低细胞密度时，Hippo通路活性低，YAP/TAZ主要位于细胞核内，驱动细胞增殖；而在高细胞密度时，通路被激活，YAP/TAZ被抑制，细胞生长停滞。然而，细胞膜上的信号是如何被传递到细胞内的Hippo激酶（如MST1/2），即细胞密度的“传感器”具体是什么，一直是该领域悬而未决的核心问题。本研究旨在寻找并阐明这一关键的密度感应机制。
研究团队以人肝癌细胞系HepG2为主要模型，结合多种体内外实验技术，展开了一场系统性的“侦探”工作。
1. 筛选与发现：Numb作为细胞密度的响应者 首先，为了寻找潜在的细胞密度传感器，研究团队在低密度和高密度条件下培养HepG2细胞，并利用数据非依赖性采集质谱技术分析了细胞膜/细胞骨架组分和细胞质组分的蛋白质组变化。同时，他们通过免疫共沉淀结合质谱分析，寻找与Hippo通路核心激酶MST2相互作用的蛋白质。通过比对这两组数据，他们筛选出45个在高/低密度下发生膜-质定位变化的候选蛋白。随后，研究人员进行了针对性的siRNA筛选，逐一敲低这些候选基因，观察其对高密度下YAP亚细胞定位的影响。结果发现，敲低Numb基因能最显著地促进高密度细胞中YAP的核内积累，提示Numb可能是感应细胞密度并调控Hippo-YAP信号的关键分子。
进一步的实验证实：在高细胞密度下，Numb蛋白从细胞质转位至细胞膜，同时YAP从细胞核转位至细胞质并被抑制；敲除Numb则破坏了高密度下的Hippo通路激活和YAP抑制，促进了细胞过度生长。有趣的是，Numb有四种主要的剪接变体（亚型）：Numb1和Numb2具有长的磷酸酪氨酸结合结构域，而Numb3和Numb4则具有截短的PTB结构域。研究发现，在高密度下，只有Numb1/2能够定位于细胞膜并激活Hippo信号，而Numb3/4则始终停留在细胞质中。
2. 上游调控：Sptan1磷酸化是Numb膜定位的“开关” 接下来，研究探索了是什么控制了Numb1/2的膜定位。通过质谱分析和siRNA筛选，他们发现细胞膜骨架蛋白非红细胞血影蛋白α链1是Numb膜定位所必需的。Sptan1本身始终位于细胞膜上，但在高密度下，它与Numb的相互作用显著增强。深入机制研究发现，高细胞密度诱导了Sptan1蛋白第1176位酪氨酸的磷酸化。这一磷酸化修饰创造了一个“对接位点”，能够被Numb1/2的长PTB结构域特异性识别和结合，从而将Numb1/2“招募”到细胞膜上。当Y1176位点突变（模拟去磷酸化状态）或抑制上游的Src激酶活性时，Numb与Sptan1的结合及其膜定位均被破坏。这一发现揭示了Sptan1的磷酸化状态是感知细胞密度变化，并控制Numb亚细胞定位的关键上游事件。
3. 下游机制：Numb通过“扣押”MARK激酶来激活MST1/2 那么，定位在膜上的Numb1/2如何激活细胞质中的Hippo激酶MST1/2呢？研究团队发现，Numb并不直接结合MST1/2，而是通过与微管亲和调节激酶MARK2/3（MST1/2的已知抑制因子）结合来发挥作用。在高密度下，Numb1/2被招募到膜上时，会像“海绵”一样将MARK2/3也一起“扣押”在细胞膜上，使其远离细胞质中的底物MST1/2。在低密度下，Numb和MARK均位于细胞质中，MARK可以自由地结合并磷酸化抑制MST1/2。 研究还发现了一个精妙的竞争机制：MST1/2的活性受其正调节因子WW45和负调节因子MARK的动态平衡控制。MST1通过同一个结构域（SARAH结构域）与WW45和MARK结合。在低密度下，细胞质中丰富的MARK与WW45竞争结合MST1/2，导致其被抑制。而在高密度下，MARK被Numb隔离在膜上，使得WW45能够顺利结合并激活MST1/2。因此，Numb通过调控MARK的亚细胞定位，间接控制了MST1/2的活性开关。
4. 体内验证与病理关联：Sptan1/Numb轴在肝脏稳态和肝癌中的作用 为了验证该机制在生理和病理状态下的重要性，研究构建了肝脏特异性敲除Numb、WW45以及双敲除的小鼠模型。单独敲除Numb在正常肝脏中未引起显著表型，但在用药物DDC诱导慢性肝损伤时，Numb缺陷小鼠表现出肝脏显著增大、肝细胞异常增殖和去分化（转分化为胆管样祖细胞），且Hippo信号减弱、YAP激活。这提示Numb在压力环境下对维持肝细胞身份和抑制异常增殖至关重要。
更具说服力的是，当同时敲除Numb和WW45时，小鼠在3月龄时即出现严重的肝脏肿大，并在6月龄时快速自发形成多发性肝肿瘤，其表型与直接敲除MST1/2类似。这一强烈的协同效应证实了Numb和WW45在体内共同拮抗MARK、激活MST1/2以抑制肿瘤发生的关键作用。此外，在Sptan1和WW45双敲除的小鼠中也观察到了类似的肝脏过度生长和肿瘤发生，且这些表型可通过敲除一个等位基因的YAP得到挽救，证明该通路确实是通过Hippo-YAP轴发挥作用，而非Numb已知的Notch信号调控途径。
为了将基础研究发现与人类疾病联系起来，研究团队分析了60对肝癌患者的肿瘤与癌旁组织。他们发现，在肝癌组织中普遍存在几个特征性变化：Sptan1的酪氨酸磷酸化水平降低；具有长PTB结构域、能激活Hippo信号的Numb1/2亚型表达相对下降，而具有截短PTB结构域、无活性的Numb3/4亚型表达显著上调；MARK2在细胞质中积累；WW45表达下调。这些变化共同导致了Hippo信号失活和YAP持续激活。体外实验也证实，高表达Numb3/4的肝癌细胞系对接触抑制不敏感，而强制将Numb3/4靶向到细胞膜上或敲低Numb3/4，则能恢复其对Hippo信号的响应并抑制肿瘤生长。
本研究取得了一系列环环相扣的重要发现： * 结果1： 鉴定出Numb（特别是Numb1/2亚型）是响应细胞密度变化、调控YAP活性的关键蛋白。其在高密度下膜定位，低密度下质定位。 * 结果2： 揭示了Numb膜定位的上游机制：高密度通过激活Src激酶，磷酸化膜骨架蛋白Sptan1的Y1176位点，进而招募Numb1/2至膜上。 * 结果3： 阐明了Numb激活Hippo通路的下游机制：膜定位的Numb1/2通过结合并隔离负调节因子MARK2/3，解除其对MST1/2的抑制，同时促进正调节因子WW45与MST1/2的结合，从而激活Hippo激酶级联反应。 * 结果4： 在肝脏特异性基因敲除小鼠模型中证实，Sptan1/Numb/WW45轴对于抑制肝细胞异常增殖、去分化和肝癌发生至关重要，且该作用依赖于YAP，而非Notch信号。 * 结果5： 在人类肝癌中发现，该调控轴存在普遍失调：Sptan1磷酸化不足、Numb活性亚型（1/2）与失活亚型（3/4）比例失衡、MARK细胞质滞留、WW45下调，共同导致Hippo信号失活和YAP驱动癌变。
这些结果构成了一个完整的信号传递链条：细胞密度增加 → Src激活 → Sptan1磷酸化（Y1176）→ 招募Numb1/2至膜上 → 扣押MARK于膜上 → 解除对MST1/2的抑制/WW45竞争性激活MST1/2 → Hippo通路激活 → YAP磷酸化并滞留于细胞质 → 细胞周期停滞。任何破坏此链条的环节（如Sptan1磷酸化降低、Numb3/4高表达、WW45缺失）都可能导致接触抑制丧失和肿瘤发生。
本研究得出结论：Sptan1/Numb1/2/MARK轴构成了一条全新的、保守的细胞密度感应机制，它将细胞外部的细胞接触信号转化为细胞内Hippo通路的激活，从而实现对细胞生长和癌变的精确遏制。
其科学价值在于： 1. 填补了关键知识空白： 首次系统性地揭示了从细胞膜到Hippo核心激酶MST1/2的完整密度感应信号传导通路，回答了该领域长期存在的核心问题。 2. 阐明了新的调控范式： 提出了通过改变抑制因子的亚细胞定位（“空间隔离”）来激活信号通路的新颖机制，即通过将MARK“扣押”在膜上来解除其对MST1/2的抑制。 3. 揭示了癌症发生的新机制： 发现Numb不同剪接亚型的平衡失调是导致Hippo信号失活和癌症发生的重要驱动因素。这为理解癌细胞如何逃逸接触抑制提供了全新视角。 4. 提供了潜在的诊疗靶点： Sptan1的磷酸化状态、Numb活性/非活性亚型的比例、MARK的定位以及WW45的表达水平，都可能成为肝癌等癌症诊断的生物标志物或药物干预的新靶点。例如，开发促进Numb1/2膜定位或抑制Numb3/4功能的策略，可能有助于恢复癌细胞的接触抑制。
这项研究不仅增进了我们对生命基本规律——接触抑制的理解，也为开发基于Hippo通路的新型抗癌策略奠定了重要的理论基础。