本研究由Yuan Ma、Quanbing Mou、Peng Yan、Zhenglin Yang、Ying Xiong、Deyue Yan、Chuan Zhang、Xinyuan Zhu和Yi Lu*等作者合作完成，涉及美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校、上海交通大学变革性分子前沿科学中心、西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室等多个研究机构。研究成果于2021年8月9日发表在Chemical Science期刊上，文章标题为”A highly sensitive and selective fluoride sensor based on a riboswitch-regulated transcription coupled with CRISPR-Cas13a tandem reaction”。
该研究属于功能核酸生物传感器领域，聚焦于阴离子检测的技术突破。氟离子（fluoride）在生物医学和环境中具有双重意义：适量氟可预防龋齿，但过量会导致氟骨症等疾病。美国环保署（EPA）规定饮用水氟含量安全范围为2-4 mg/L（105-211 μM），但现有检测方法（如氟离子选择性电极）存在设备昂贵、操作复杂等问题。尽管核酸传感器已成功应用于带正电或中性分子检测，但由于阴离子的高水合能和低亲和力特性，针对氟离子的核酸传感器开发长期面临挑战。研究团队旨在开发一种基于核糖开关（riboswitch）和CRISPR-Cas13a串联反应的新型传感器，实现水溶液中氟离子的高灵敏度、高选择性检测。
研究采用”氟离子核糖开关调控转录-CRISPR-Cas13a信号放大”串联系统（FRIT-Cas13a）。其核心机制分为两个阶段： - 转录调控阶段：氟离子结合核糖开关后，抑制转录终止，生成包含Cas13a靶向序列的全长RNA转录本。转录效率与氟浓度呈正相关。 - 信号放大阶段：转录产生的RNA激活Cas13a蛋白的侧链切割活性，切割带有荧光基团（FAM）和淬灭基团（BHQ1）的RNA报告探针，释放荧光信号。
（1）DNA模板构建 - 通过连接反应构建包含T7启动子、氟离子核糖开关和Cas13a靶向序列的DNA模板（序列设计见图S1） - 使用10%变性PAGE胶验证模板纯度（图S2）
（2）体外转录优化 - 测试不同NTP浓度（10/20/30 mM）下的氟离子依赖性转录效率（图1） - 温度优化实验显示37℃时转录效率最高（图S5-S6） - 放射性标记实验证实转录通读率（readthrough）与氟浓度（0-1 mM）呈剂量依赖关系（图1b）
（3）CRISPR-Cas13a系统优化 - 比较三种反应缓冲液，确定Buffer1（文献57）具有最佳信噪比（图S7） - 建立65℃ 10分钟的热灭活程序以稳定荧光信号（图S8） - 开发便携式荧光检测方案，使用商用荧光仪实现现场检测（图4a）
（4）性能验证实验 - 灵敏度测试：检测限达1.7 μM（EPA标准方法的1/16） - 选择性测试：在200 μM浓度下，对Cl⁻、Br⁻等11种阴离子的响应可忽略（图3） - 抗干扰测试：验证Na⁺/K⁺等阳离子及核酸酶预处理的影响（图S11-S12） - 实际样本检测：与氟离子电极法对比，在自来水、湖水等样本中显示良好相关性（R²=0.9895）（图2d）
该研究首次将核酸传感器应用扩展至阴离子检测领域，其科学价值体现在： 1. 机制创新：创造性地结合核糖开关的天然识别能力与CRISPR-Cas13a的信号放大功能 2. 技术突破：解决了阴离子检测中水合能高、亲和力低的技术瓶颈 3. 应用潜力：建立的便携式检测系统（图4）满足EPA对饮用水监测的精准需求
研究发现核糖开关在30 mM NTP条件下呈现最优调控动态范围（图1），这一发现为后续设计类似调控系统提供了关键参数参考。此外，研究团队开发的模块化DNA模板构建方法（图S1）可推广至其他小分子传感器的开发。
（注：文中图/表编号保持与原文一致，专业术语如”riboswitch”等首次出现时标注英文原词）