研究报告：聚赖氨酸修饰MXene纳米片负载葡萄糖氧化酶构建级联纳米反应器用于葡萄糖分解及电化学传感

本研究发表于 *Journal of Colloid and Interface Science*， 卷586，页码20–29，于2021年正式发表。文章在线发表日期为2020年10月26日，由来自复旦大学、温州大学、佛山大学和澳大利亚CSIRO制造研究所等多个机构的科研人员合作完成。主要作者包括Minying Wu、Qian Zhang、Yuanyuan Fang、通讯作者Chao Deng、Yi Zhang及Yajun Wang等。通讯单位分别为温州大学（Chao Deng）、佛山大学（Yi Zhang）和复旦大学（Yajun Wang）。论文题目为《Polylysine-modified MXene nanosheets with highly loaded glucose oxidase as cascade nanoreactor for glucose decomposition and electrochemical sensing》。

一、 学术背景

该研究属于纳米生物技术与电化学生物传感的交叉领域，旨在开发新型、高性能的葡萄糖生物传感器。其核心科学背景围绕两点展开：葡萄糖氧化酶(GOx)的利用瓶颈与二维MXene纳米材料的新兴应用。

葡萄糖氧化酶是一种能够催化β-D-葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢(H2O2)的氧化还原酶。由于其在生物传感、糖尿病监测、癌症治疗和生物燃料电池等领域有广泛应用前景，是研究和应用的重点。然而，GOx在催化葡萄糖氧化过程中会产生有毒中间产物H2O2，后者会抑制甚至使GOx失活，这是限制其实际应用效率和稳定性的关键问题。传统策略是构建多酶级联反应系统，引入第二种酶（如过氧化氢酶）来分解H2O2，但这增加了系统的复杂性和成本。

另一方面，MXenes作为一类新兴的二维过渡金属碳化物、氮化物或碳氮化物纳米材料，因其出色的导电性、高比表面积、亲水性以及丰富的表面化学性质而备受关注。Ti3C2 MXene是该家族中被研究最广泛的成员之一。研究表明，Ti3C2不仅具有良好的导电性，还展现出催化分解H2O2的类过氧化物酶活性。这一特性为解决GOx体系中H2O2的毒害问题提供了全新思路：能否将GOx直接负载于兼具高导电性和H2O2分解活性的Ti3C2 MXene上，构建一种单一基底的级联纳米反应器？

基于此，本研究提出并实现了一个创新构想：利用富含氨基的多肽——聚-L-赖氨酸(PLL)——来修饰Ti3C2 MXene纳米片，提供一个生物相容性好且带正电荷的表面，从而高效、稳定地负载带负电荷的GOx。PLL与GOx通过共价交联形成牢固的网络结构。最终得到的Ti3C2-PLL-GOx杂化纳米反应器，不仅实现了高达50 wt.%的GOx载量，更重要的是，GOx催化葡萄糖氧化产生的H2O2，能够被Ti3C2基底本身快速催化分解。分解产生的氧气可被GOx循环利用于葡萄糖氧化反应，从而形成一个级联催化循环。这种设计有望显著提升GOx的催化活性和稳定性。此外，利用Ti3C2优异的导电性，该杂化材料可进一步用于构建高灵敏度的电化学生物传感器。

本研究的目标是：1) 开发一种高效的、基于PLL修饰MXene的GOx固定化新方法；2) 验证该杂化纳米反应器在葡萄糖氧化级联反应中的协同增效作用；3) 探索其作为高性能葡萄糖电化学传感平台的潜力，并评估其检测性能。

二、 详细研究流程

研究流程主要分为五个关键步骤：Ti3C2 MXene纳米片的合成、Ti3C2-PLL-GOx杂化纳米片的组装、材料表征与酶负载量分析、酶活性、稳定性和级联反应机制研究、葡萄糖电化学传感器构建与性能测试。

第一步：Ti3C2纳米片的制备

本研究采用经典的LiF/HCl选择性蚀刻法，从其前体MAX相Ti3AlC2制备多层Ti3C2。具体过程为：将2.0 g Ti3AlC2粉末缓慢加入含有2.0 g LiF和20 mL HCl（浓度为9 M）的混合溶液中，在50°C油浴中磁力搅拌反应48小时，以蚀刻掉Al层。反应结束后，通过离心和反复水洗直至上清液pH约为6，得到多层Ti3C2沉淀。为了获得超薄纳米片，将沉淀物重新分散于40 mL N-甲基吡咯烷酮（NMP）中，并使用探针超声仪在冰浴条件下进行超声剥离。超声功率为260 W，工作/间歇时间设置为4秒/2秒，总时长为8小时。超声处理后，离心去除未剥离的厚片，将含有超薄纳米片的上清液冻干，得到最终的Ti3C2 MXene纳米片粉末。

第二步：Ti3C2-PLL-GOx杂化纳米片的组装

1. PLL修饰 (Ti3C2-PLL)： 将0.5 mL的Ti3C2纳米片悬浮液（1.0 mg/mL）与0.5 mL的PLL溶液（1.0 mg/mL，溶于pH 5.5、50 mM的MES缓冲液中）混合，室温振荡1小时。通过离心（16000g，5分钟）收集沉淀，并用MES缓冲液洗涤两次，最后重悬于0.5 mL MES缓冲液中。此步骤利用Ti3C2表面的负电荷与带正电荷的PLL之间的静电作用进行修饰。
2. GOx吸附与交联 (Ti3C2-PLL-GOx)： 将0.5 mL GOx溶液（1.0 mg/mL，溶于pH 5.5、50 mM的MES缓冲液）加入到上述Ti3C2-PLL悬浮液中，室温振荡1小时，通过静电吸附完成GOx负载。通过离心除去过量GOx后，向沉淀物中加入0.5 mg EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，溶于MES缓冲液），室温孵育1小时。EDC作为交联剂，催化GOx分子上的羧基与PLL链上的氨基发生共价交联，形成稳定的GOx-PLL网络覆盖在MXene纳米片表面。最终产物用MES缓冲液洗涤两次，分散于pH 5.0的醋酸钠缓冲液中备用。

第三步：材料表征与酶负载分析

研究采用了全面的表征手段来分析材料的结构和性质： * 形貌与结构表征： 利用扫描电子显微镜（SEM）观察Ti3AlC2前体和多层Ti3C2的层状结构。通过透射电子显微镜（TEM）和高分辨TEM（HRTEM）确认了超声剥离后得到的超薄Ti3C2纳米片形貌、尺寸（约200 nm）和晶格条纹（0.265 nm，对应（011̅0）晶面）。原子力显微镜（AFM）测量显示纳米片厚度约为1.2-2.5 nm，表明其为单层或少层结构。X射线衍射（XRD）图谱的变化（如（002）峰从9.6°移至6.6°）证实了Al层的成功蚀刻和层间距的扩大。拉曼光谱（Raman）和紫外-可见光谱（UV-Vis）进一步确认了Ti3C2的特征结构。 * 表面性质与负载验证： Zeta电位测量显示，原始Ti3C2带负电（-26.2 mV），PLL修饰后变为+28.7 mV，GOx负载后又变为-20.3 mV，证实了每一步改性的成功。傅里叶变换红外光谱（FTIR）中1685 cm⁻¹和1566 cm⁻¹处出现的酰胺I带和酰胺II带，是PLL和GOx中肽键的特征峰，证明了GOx的成功固定。TEM元素映射（尤其是P元素分布）证实了GOx在纳米片表面的均匀分布。 * GOx负载量测定： 通过UV-Vis光谱监测上清液中GOx的浓度变化来计算载量。研究发现，未修饰的Ti3C2在pH 5.5的缓冲液中GOx负载量约为18.7 wt.%，而经PLL修饰后，负载量大幅提升至50.4 wt.%。对比同样用PLL修饰的三维介孔二氧化硅（BMS）颗粒，Ti3C2-PLL的负载速度更快、载量更高，这归因于二维纳米片拥有更大且更易接近的外表面。

第四步：酶活性、稳定性和级联反应机制研究

1. 酶活性与负载量的关系： 研究了GOx负载量（5, 10, 30, 50 wt.%）对活性的影响。以游离GOx的活性为100%，发现随着负载量增加，相对活性逐渐下降。负载量为10 wt.%的Ti3C2-PLL-GOx活性（84.5%）与5 wt.%（85.1%）相近，而负载量50 wt.%的样品活性降至77.8%。这表明过密的负载可能阻塞部分酶的活性位点。最终选择10 wt.%载量的样品进行后续研究，以平衡高负载与高活性。
2. 级联反应验证与协同效应： 这是本研究的核心机制验证。作者首先证明了Ti3C2纳米片自身具有催化分解H2O2的能力。将Ti3C2加入H2O2溶液中，4小时内分解了约0.79 mM的H2O2。 为了验证级联反应，研究人员设计了对照实验。将Ti3C2-PLL-GOx纳米反应器与负载在惰性多孔二氧化硅颗粒（BMS-PLL-GOx）上的GOx进行对比。在隔绝大气的封闭体系中（溶液上层覆盖正己烷以防止大气氧进入），监测葡萄糖的分解和H2O2的生成。
   • 葡萄糖分解： 在反应的第一小时内，Ti3C2-PLL-GOx分解了2.09 mM葡萄糖，而BMS-PLL-GOx仅分解了1.48 mM。前者活性（3.47 U）显著高于后者（2.46 U）。
   • H2O2生成： 在BMS-PLL-GOx体系中，检测到的H2O2浓度随反应时间逐渐升高。然而，在Ti3C2-PLL-GOx体系中，虽然分解了更多葡萄糖（理应产生更多H2O2），实际测得的H2O2浓度却始终显著低于前者，且二者差距随时间扩大。 这个结果直接证明了级联反应的发生：GOx催化葡萄糖氧化生成的H2O2，被Ti3C2基底迅速分解为水和氧气。分解产生的氧气又被GOx循环利用，从而加速了葡萄糖氧化反应的总速率，同时减少了体系中H2O2的积累和对酶的毒害。
3. 操作稳定性研究： 在六次重复使用的批式反应后，Ti3C2-PLL-GOx纳米反应器保持了81%的初始活性。而GOx直接吸附在未经PLL修饰的Ti3C2上时，仅保留47%的活性。这表明PLL交联不仅提升了GOx的负载量，也显著增强了固定化酶的稳定性，防止其在循环使用中脱落或失活。

第五步：葡萄糖电化学传感器构建与性能测试

1. 电极制备： 将Ti3C2-PLL-GOx悬浮液（5.0 µL）滴涂于预先抛光清洁的玻碳电极（GCE）表面，自然干燥，得到Ti3C2-PLL-GOX/GCE工作电极。
2. 电极界面性质： 通过电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）研究了电极的电化学性质。EIS结果表明，纯Ti3C2修饰的GCE电阻极小（2.26 Ω），证明MXene优异的导电性。负载了非导电的PLL和GOx后，电极电阻（137.8 Ω）虽有所增加，但仍显著低于未修饰的裸GCE（70.8 Ω），表明Ti3C2基底有效促进了电极界面的电子传输。
3. 葡萄糖传感性能： 在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，通过监测不同浓度葡萄糖加入时CV曲线中还原峰电流的下降（因酶反应消耗氧气），构建了葡萄糖浓度与电流响应的关系。
   • 线性范围与检测限： 传感器表现出双线性范围：0.02–1.1 mM 和 4.0–20 mM。在低浓度范围，线性方程为 i(µA) = -2.6988 C(mM) – 12.539 (R²=0.9981)。
   • 灵敏度： 计算得到的检测灵敏度分别为 38.18 µA mM⁻¹ cm⁻²（低浓度范围）和 71.42 µA mM⁻¹ cm⁻²（高浓度范围），远高于文献报道的基于GOx/Au/MXene/Nafion/GCE电极的灵敏度（4.2 µA mM⁻¹ cm⁻²）。
   • 检测限： 葡萄糖的检测限低至 2.6 µM。
   • 稳定性： 经过100次循环伏安扫描后，电极电流信号仍保持初始值的85%以上，显示出良好的操作稳定性。

三、 主要结果

1. 成功制备了超薄Ti3C2 MXene纳米片： 通过LiF/HCl蚀刻和超声剥离，得到了尺寸约200 nm、厚度1.2-2.5 nm的单层或少层Ti3C2纳米片，其表面带负电荷，具有良好的分散性和优异的导电性。
2. PLL修饰极大提升了GOx的负载能力： PLL在Ti3C2表面形成的带正电荷多肽层，通过静电作用强力吸附带负电的GOx，并利用EDC交联形成稳定的网络。最终实现了高达50.4 wt.%的GOx载量，且酶在二维表面的分布均匀。
3. 构建了高效的葡萄糖氧化级联纳米反应器： Ti3C2-PLL-GOx复合物中的Ti3C2基底不仅能高容量负载GOx，还能高效催化GOx反应产生的有毒副产物H2O2分解。这种级联设计将H2O2分解为水和可循环利用的氧气，不仅消除了H2O2对GOx的抑制作用，还为葡萄糖氧化反应补充了反应物，从而显著提升了整体催化活性和反应效率（相较于惰性载体BMS-PLL-GOx）。
4. PLL修饰显著增强了固定化酶的稳定性： 通过共价交联，GOx被牢固地锚定在PLL网络中，防止其在使用过程中脱落。实验证明，经过六次重复使用，Ti3C2-PLL-GOx的酶活性保留率（81%）远高于仅靠物理吸附在Ti3C2上的GOx（47%）。
5. 开发出高性能葡萄糖电化学传感器： 利用Ti3C2-PLL-GOx的级联催化活性和Ti3C2优异的导电性，构建的GCE电极对葡萄糖展现出优异的传感性能。其具有双线性检测范围（0.02–1.1 mM 和 4.0–20 mM）、高达38.18 µA mM⁻¹ cm⁻²的灵敏度（低浓度范围）、低至2.6 µM的检测限以及良好的稳定性。电极的高性能归因于：Ti3C2基底促进的直接电子转移、超薄纳米片提供的高比表面积使酶活性位点高度可及，以及级联反应带来的高催化效率。

四、 结论与价值

本研究开发了一种新型的、基于聚赖氨酸（PLL）修饰Ti3C2 MXene纳米片的高效级联纳米反应器（Ti3C2-PLL-GOx），用于葡萄糖氧化和电化学传感。其核心贡献在于： * 科学价值： 提出并验证了一种新颖的“酶-二维纳米材料”级联催化策略。利用MXene材料（Ti3C2）既作为高效酶固定化平台，又作为催化H2O2分解的“助手催化剂”这一双重功能，构建了单基底的级联反应系统。该策略避免了使用多种酶的复杂性，为设计高效、稳定的酶固定化系统与仿生催化体系提供了新范式。此外，PLL作为一种生物相容性多肽，为MXene表面功能化提供了普适性方法，有望拓展至其他酶的固定。 * 应用价值： 成功将上述纳米反应器应用于电化学葡萄糖传感，构建了性能卓越的生物传感器。其灵敏度、检测限和稳定性均优于许多已报道的基于GOx的传感器，在糖尿病监测、食品分析、生物过程监控等领域具有明确的应用潜力。同时，该工作也为开发用于生物燃料电池、生物催化转化等领域的其他高性能电极材料开辟了新途径。

五、 研究亮点

1. 创新的级联反应设计： 首次将GOx与兼具类过氧化物酶活性和高导电性的Ti3C2 MXene相结合，构建了单一材料基底的双功能（葡萄糖氧化和H2O2分解）级联纳米反应器，实现了反应中间产物的原位消除和反应物氧气的循环利用，显著提升了催化效率。
2. 高效且普适的酶固定化策略： 利用PLL修饰MXene，不仅通过静电作用实现了对GOx的超高负载（>50 wt.%），还通过共价交联极大地增强了固定化酶的稳定性和重复使用性。该方法简单有效，为MXene纳米片的生物功能化提供了通用策略。
3. 高性能生物传感平台的构建： 充分利用Ti3C2 MXene的二维形貌（高比表面积）和卓越导电性，以及级联反应带来的高催化活性，制备的葡萄糖电化学传感器在灵敏度、检测限和线性范围方面均表现出优异性能，为下一代生物传感器的发展提供了新思路。

六、 其他有价值内容

• 文章中详细比较了二维纳米片（Ti3C2）与三维多孔颗粒（BMS）在酶吸附动力学和容量上的差异，揭示了二维材料表面在提供快速、高效酶负载方面的独特优势。
• 除了电化学传感应用，研究中对Ti3C2催化分解H2O2能力的验证，也暗示了该材料在抗感染、肿瘤治疗（化学动力学疗法）等涉及活性氧调控的生物医学领域的潜在应用价值。
• 作者在补充材料（Supporting Information）中提供了葡萄糖和H2O2的标准曲线、Ti3AlC2原料的物相分析、元素