本研究报告介绍了一项发表于《eBioMedicine》期刊（2021年，第64卷，文章编号103235）上的原创性研究。该研究由日本理化学研究所综合医科学研究所人类疾病模型实验室的Anne P. de Groot、Fumihiko Ishikawa（通讯作者）等人领衔，联合了日本国立癌症研究中心医院、东京医科齿科大学、美国杰克逊实验室等多个机构的科研人员共同完成。

学术背景与研究目的

本研究聚焦于急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukaemia, ALL）中预后极差的一个亚型——混合谱系白血病基因重排型ALL（MLL-rearranged ALL， 简称MLL-ALL）。这种白血病在婴儿中高发，其治疗面临的核心挑战之一是对糖皮质激素（Glucocorticoids, GCs， 如地塞米松）的耐药性。尽管糖皮质激素是ALL标准治疗中的关键药物，但MLL-ALL细胞极易产生耐药性，导致原发性难治或疾病复发，这是改善患者临床结局的主要障碍。

先前的研究提供了一些线索：MLL-ALL细胞高表达Fms样酪氨酸激酶3（Flt3），且其下游信号通路持续激活；同时，Src家族激酶（Src-family kinases， SFKs）的磷酸化也被认为与糖皮质激素耐药有关。这些激酶被认为是潜在的药物靶点。然而，这些发现大多基于体外细胞实验，缺乏在能够模拟患者个体异性和耐药性的体内模型中进行验证。因此，本研究旨在：1）建立一个能够复现MLL-ALL患者糖皮质激素耐药性的临床前动物模型；2）基于生物信息学分析，寻找克服耐药的关键靶点通路；3）在体内模型中验证靶向这些通路（特别是SFKs和Flt3）是否能克服糖皮质激素耐药；4）进一步探究并解决可能出现的次级耐药机制，从而开发出全新的、有效的联合治疗方案。

详细研究流程

本研究设计严谨，流程环环相扣，主要包含以下几个核心步骤：

第一步：构建并验证患者来源异种移植模型。 研究团队从15名MLL-ALL患者和5名非MLL-ALL患者中获取了骨髓或外周血样本。通过细胞分选，分离出白血病起始细胞（Leukaemia-initiating cells， LICs），并将其移植到免疫缺陷的NSG新生小鼠体内，成功构建了患者来源异种移植（Patient-derived xenograft， PDX）模型。这些模型保留了原代肿瘤的遗传和表型特征。当小鼠外周血中人造血细胞（hCD45+）嵌合率达到20%以上时，开始进行体内药效评估。研究人员首先给携带不同MLL融合基因（如MLL-AF4， MLL-ENL， MLL-AF9）的PDX小鼠使用地塞米松（30 mg/kg/天）。结果显示，在大多数小鼠（27只中的16只）中，地塞米松仅能短暂降低白血病负荷，随后细胞再次增殖，成功在体内复现了人类患者的糖皮质激素耐药现象。

第二步：通过生物信息学分析识别关键耐药通路。 为了寻找克服耐药的新靶点，研究人员对MLL-ALL患者LICs与正常造血干/祖细胞的转录组进行了比较分析。他们利用此前已发表及新生成的微阵列数据，通过R Studio和Bioconductor系列软件包（如limma）进行差异表达基因分析，识别出915个显著差异基因。利用STRING数据库进行蛋白互作网络分析，发现MLL-ALL细胞中与凋亡、SFKs、JAK家族及S100蛋白相关的基因簇显著富集。其中，SFK通路成员HCK、BLK以及ANXA2、S100A10的转录本水平升高。此外，KEGG通路富集分析显示，PI3K-Akt、MAPK、Ras等多个激酶相关信号通路在MLL-ALL细胞中被激活。尽管在RNA水平上NF-κB、S6等基因未见过表达，但流式细胞术检测磷酸化蛋白水平证实，pNF-κB、pS6、p4EBP1和pAkt在MLL-ALL细胞中显著升高，提示SFK/Flt3下游通路在蛋白功能层面被激活。这些分析结果将SFK和Flt3信号通路锁定为克服糖皮质激素耐药的关键候选靶标。

第三步：在PDX模型中验证SFK/Flt3抑制剂RK-20449的疗效。 基于上述发现，研究团队在PDX模型中测试了RK-20449（一种由该团队先前开发的可同时抑制SFKs和Flt3的小分子化合物）的疗效。他们将携带MLL-ALL的小鼠分为四组：对照组、单用地塞米松组、单用RK-20449组、地塞米松与RK-20449联合治疗组。治疗期间持续监测外周血白血病嵌合率。结果表明，单药治疗（无论是地塞米松还是RK-20449）效果有限或不持久。然而，联合治疗能迅速、显著地降低外周血中的hCD45+细胞，并近乎完全清除骨髓和脾脏中的白血病细胞。免疫组化结果进一步证实，联合治疗组小鼠的骨髓、脾脏、肝脏、肾脏中的人源白血病细胞浸润被有效清除，同时小鼠的自身造血得到恢复。生存分析显示，联合治疗能显著延长小鼠的生存期，并且基于Bliss模型的算法证实两药联用具有协同增效作用。然而，在部分病例（如患者11来源的PDX模型）中，即使联合治疗，仍能在骨髓和脾脏中检测到残留的白血病细胞，提示存在其他耐药机制。

第四步：利用BH3谱分析技术探究次级耐药机制并验证Bcl-2抑制剂。 为了攻克残留的耐药细胞，研究人员将目光转向了在第一步分析中同样富集的凋亡通路。他们采用了一项创新的功能性检测技术——BH3谱分析（BH3 profiling）。该技术通过将细胞暴露于不同的促凋亡BH3域模拟肽（如BIM、NOXA、HRK、BAD），并检测线粒体细胞色素c的释放程度，来评估细胞对特定抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL）的依赖性。对8例MLL-ALL PDX细胞的分析显示，所有病例的细胞对BIM肽（泛促凋亡激活剂）均敏感。更重要的是，在特异性肽中，BAD肽（主要拮抗Bcl-2和Bcl-xL）能最有效地诱导细胞色素c释放，表明MLL-ALL细胞的生存高度依赖于Bcl-2蛋白。体外实验证实，对于从联合治疗（地塞米松+RK-20449）后仍存活的耐药细胞，额外加入Bcl-2选择性抑制剂ABT-199（Venetoclax）能有效将其清除，而对正常人造血干细胞和T细胞毒性较小。

第五步：三重联合治疗的体内验证。 最终，研究团队在PDX模型中测试了“地塞米松 + RK-20449 + ABT-199”的三重联合方案。结果令人振奋：对于之前对双药联合治疗仍表现耐药的患者4和患者11来源的模型，三重治疗能够完全清除小鼠外周血、骨髓及脾脏中的hCD45+白血病细胞，达到了深度缓解的效果。免疫组化图片直观地展示了三重治疗后小鼠骨髓中白血病细胞被彻底清除、正常造血组织结构恢复的景象。

主要研究结果

1. 成功构建并验证了MLL-ALL糖皮质激素耐药的PDX模型：该模型成功模拟了患者原代肿瘤在体内的生物学行为和对地塞米松的治疗反应，为临床前药效评估提供了可靠平台。
2. 生物信息学分析揭示SFK/Flt3通路是关键耐药枢纽：转录组和磷酸化蛋白水平分析共同表明，MLL-ALL细胞中SFK和Flt3信号网络被异常激活，这为靶向治疗提供了理论基础。
3. 双靶点抑制剂RK-20449联合地塞米松在体内展现强大疗效：在多数PDX模型中，该联合方案能显著清除白血病细胞，延长小鼠生存，且具有协同作用，证明了同时抑制SFK和Flt3是克服MLL-ALL糖皮质激素耐药的有效策略。
4. BH3谱分析揭示Bcl-2依赖性是次级耐药的关键机制：该技术直接、功能性地鉴定出残留的白血病细胞通过上调Bcl-2来逃避凋亡，为下一步干预指明了方向。
5. 三重联合疗法实现完全清除：在双药联合基础上加入ABT-199，能成功消除最具耐药性的白血病细胞，在PDX模型中达到了治愈性效果，证明了多层次靶向（激酶信号+抗凋亡蛋白）策略的优越性。

结论与意义

本研究得出结论：SFKs和Flt3信号通路是治疗耐药性MLL-ALL的极具前景的靶点。联合抑制这些激酶通路和抗凋亡蛋白Bcl-2，能够成功清除高度耐药的白血病细胞。这为治疗预后极差的婴儿MLL-ALL提出了一种全新的、基于机制的治疗策略。

其科学价值在于：1）系统性地从基因表达、信号通路、细胞功能到动物模型等多个层面，阐明了MLL-ALL糖皮质激素耐药及克服耐药的双层机制（激酶通路激活与Bcl-2依赖性生存）。2）成功将基础研究发现（激酶抑制剂RK-20449、BH3谱分析技术）转化为具有明确治疗前景的临床前方案。3）强调了针对复杂、耐药性白血病，采用多靶点、多层次联合治疗策略的重要性。

其应用潜力巨大：本研究提出的“地塞米松 + RK-20449（或类似双激酶抑制剂） + Venetoclax”三联方案，为开展针对难治/复发MLL-ALL的临床试验提供了坚实的临床前数据支持，有望改善这类高危患者的生存结局。

研究亮点

1. 模型的创新性与临床相关性：使用的PDX模型直接来源于患者原代细胞，能更好地保留肿瘤异质性和体内微环境相互作用，其复现的糖皮质激素耐药表型与临床挑战高度一致，使研究成果的转化意义更强。
2. 研究逻辑的严密性与递进性：从临床问题（耐药）出发，通过组学分析寻找靶点，在PDX模型中验证初步方案，遇到次级耐药后利用先进技术（BH3谱分析）深挖机制，最终提出并验证优化方案，整个研究链条完整、逻辑清晰。
3. 技术方法的先进性：特别是BH3谱分析技术的应用，它不是简单地测量蛋白表达量，而是功能性评估细胞的“凋亡预备状态”和对特定抗凋亡蛋白的依赖，能够更精准地指导靶向凋亡通路的治疗。
4. 治疗策略的协同性与突破性：研究不仅验证了双激酶抑制的有效性，更进一步发现了其与Bcl-2抑制的协同作用，最终提出的三重联合方案在PDX模型中显示了治愈潜力，为这类公认的难治白血病带来了新的希望。

其他有价值的内容

研究还表明，SFK/Flt3通路下游的部分基因（如HCK， IL7R）在非MLL的某些ALL亚型（如Ph+ ALL， ETV6-RUNX1 ALL）中也有上调，暗示本研究揭示的靶向激酶的治疗思路可能具有一定的普适性，值得在其他耐药性ALL中探索。此外，研究中对正常造血细胞毒性的评估（三重方案对正常HSC和T细胞影响较小）也为其潜在的安全性提供了初步依据。所有微阵列数据已公开共享，体现了研究的可重复性和开放性。