学术研究报告：针对KRAS突变结直肠癌的新型吖啶衍生物LS-1-2的发现及其机制研究

本研究由Jin Gu（北京大学肿瘤医院 & 研究所 胃肠肿瘤外科，分子肿瘤学教育部重点实验室）和Xiangbao Meng（北京大学 天然药物及仿生药物国家重点实验室）作为共同通讯作者领导完成，合作单位包括北京大学首钢医院、清华大学、北京大学-清华大学生命科学联合中心及承德医学院附属医院等。研究成果以题为“Kras-Driven Hypertranscription and Metastatic Dissemination in Colorectal Cancer Could Be Overcome by Targeting the NMHC IIa/ PLK1 Signaling Axis with a Novel Acridine Derivative”的原创研究论文形式，于2026年1月1日发表在国际期刊《International Journal of Biological Sciences》上。

一、 研究背景与目的 本研究的核心科学领域为肿瘤学，特别是结直肠癌的靶向治疗。KRAS是结直肠癌中最常见的致癌驱动基因之一，约45%的患者携带KRAS突变。携带KRAS突变的转移性结直肠癌患者预后更差，生存期更短。尽管针对特定KRAS G12C突变的药物已取得进展，但该突变在结直肠癌中的发生率很低，绝大多数KRAS突变型（特别是非G12C）的转移性结直肠癌，尤其是对标准治疗（如氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂）产生耐药的难治性患者，仍然缺乏有效的治疗手段，这构成了临床上一个亟待解决的关键需求。因此，本研究旨在针对KRAS突变型、微卫星稳定型的难治性转移性结直肠癌，发现新的有效治疗化合物并阐明其作用机制。

二、 研究流程与方法详述 本研究采用了一个从临床样本到分子机制的完整、多层次的研究体系，其工作流程可概括为：模型建立与表征→高通量药物筛选→先导化合物发现与优化→体内外药效验证→多组学机制探索→靶点鉴定与功能验证→临床相关性分析。

1. 研究模型的建立与表征： 研究团队首先从KRAS突变型微卫星稳定型转移性结直肠癌患者（包括对多种化疗方案耐药的患者）体内获取肿瘤组织，构建了一系列患者来源类器官和患者来源异种移植模型。这些模型被用作后续药物筛选和机制研究的平台。为了解KRAS突变的分子特征，研究人员对KRAS突变型和野生型的PDOs进行了RNA测序分析，并利用已发表的单细胞RNA测序数据分析了KRAS突变型与野生型CRC上皮细胞的转录组差异。这些分析旨在揭示KRAS突变引起的特异性生物学改变。

2. 高通量药物筛选与先导化合物发现： 基于建立的PDOs和细胞系模型，研究团队实施了一个双平台筛选策略。他们构建了一个包含786种美国食品药品监督管理局（FDA）已批准抗癌药物的库进行高通量筛选。筛选旨在寻找能有效抑制KRAS突变型PDOs和细胞系生长的化合物。初筛结果将吖啶类化合物盐酸安吖啶鉴定为一个强效抑制剂。然而，考虑到安吖啶在实体瘤中疗效有限，研究团队随后通过结构导向的“骨架跃迁”策略，设计并合成了一个包含131个吡咯并[2,3,4-kl]吖啶-1(2H)-酮衍生物的内部化合物库，并对其进行进一步筛选。最终，化合物LS-1-2因其对KRAS突变型细胞显示出选择性抑制活性而被选定为临床前候选药物。

3. 体内外药效学评价： 研究在体外广泛测试了LS-1-2对多种KRAS突变型和野生型结直肠癌细胞系、化疗耐药细胞系（如HCT8-5FU）、癌症干细胞富集细胞（HCT116/self）以及患者来源类器官的增殖抑制活性，并计算了半数抑制浓度。此外，还评估了LS-1-2对癌细胞迁移、侵袭、肿瘤球形成能力以及癌症干细胞标志物表达的影响。在体内，研究使用了KRAS突变型细胞系来源的异种移植模型和四种不同的患者来源异种移植模型（包括来自原发灶、肝转移灶以及经新辅助放化疗后复发转移灶的模型），评价了LS-1-2单药以及与标准化疗药（5-FU， CPT-11）相比的抗肿瘤效果。特别地，还建立了一个脾脏注射-肝转移小鼠模型，通过活体生物发光成像定量评估LS-1-2抑制结直肠癌肝转移的效力，并与临床药物TAS-102进行了比较。

4. 多组学机制探索： 为了系统阐明LS-1-2的作用机制，研究采用了整合的多组学分析方法。对LS-1-2处理后的细胞进行了定量磷酸化蛋白质组学分析和RNA测序。磷酸化蛋白质组学用于全局性地发现受LS-1-2调控的磷酸化位点和激酶活性。RNA测序则用于分析基因表达谱的变化。通过KEGG通路富集分析和STRING蛋白互作网络分析，将两组学数据关联，以识别受LS-1-2影响的核心信号通路。此外，还利用生物信息学工具（如GPS算法）预测了受调控磷酸化位点对应的激酶。

5. 直接作用靶点的鉴定与验证： 这是一个关键的技术环节。研究团队合成了生物素标记的LS-1-2探针，利用亲和下拉技术结合液相色谱-串联质谱从细胞裂解液中钓取并鉴定与LS-1-2直接结合的蛋白质。通过细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）在完整细胞和裂解液中验证LS-1-2与候选靶蛋白的直接结合及其引起的热稳定性变化。进一步，通过基因敲低、过表达及点突变等分子生物学手段，在功能上验证该靶蛋白是否为LS-1-2发挥药效所必需。此外，还进行了分子对接和分子动力学模拟，预测LS-1-2与靶蛋白的结合模式和引起的构象变化。

6. 靶点功能与下游信号通路解析： 在确定直接靶点后，研究深入探索了靶蛋白磷酸化修饰的功能及其下游信号传导机制。通过构建靶蛋白关键磷酸化位点的突变体（模拟持续磷酸化或不可磷酸化），在细胞中研究这些突变对癌细胞增殖、侵袭、迁移等表型的影响，以及对相关信号通路（如MAPK/ERK, PI3K/AKT, Hippo, FOXO等）关键蛋白表达和磷酸化状态的影响。同时，结合磷酸化蛋白质组学数据，分析了靶蛋白与哪些信号通路蛋白存在相互作用。

7. 临床相关性分析： 研究利用临床蛋白质组肿瘤分析联盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium, CPTAC）的公共数据，分析了靶蛋白及其特异性磷酸化水平在结直肠癌组织与正常组织中的差异，以及它们与肿瘤TNM分期、转移等临床病理特征的相关性。此外，研究团队还对自己收集的临床样本进行了免疫组织化学染色，分析靶蛋白磷酸化水平与患者生存预后（总生存期、无病生存期）之间的关联。

三、 主要研究结果 1. KRAS突变诱导全局性高转录（Hypertranscription）： RNA测序和单细胞RNA测序分析一致表明，与KRAS野生型相比，KRAS突变型结直肠癌类器官和上皮细胞的基因表达谱显著富集于RNA代谢、DNA模板转录、RNA聚合酶II调控等生物学过程和通路。这提示KRAS突变驱动了癌细胞的全局转录活性升高，可能创造了新的治疗脆弱性。

2. 高通量筛选鉴定出吖啶类先导化合物： 从FDA药物库中筛选出盐酸安吖啶等对KRAS突变模型有效的化合物。进一步通过内部化合物库筛选，发现了新型吖啶衍生物LS-1-2。LS-1-2在体外对多种KRAS突变型结直肠癌细胞系、化疗耐药细胞、癌症干细胞以及患者来源类器官均表现出纳摩尔级别的强效增殖抑制活性，且对KRAS突变型显示出一定的选择性。

3. LS-1-2在体内有效抑制肿瘤生长和转移，且克服化疗耐药： 在多种CDX和PDX模型中，LS-1-2（40 mg/kg）单药治疗能显著抑制肿瘤生长，其效果优于或相当于标准化疗药5-FU和CPT-11。更重要的是，在来源于对5-FU耐药、对新辅助放化疗后复发转移患者的PDX模型（PDX4）中，LS-1-2依然表现出强大的抗肿瘤活性。在肝转移模型中，LS-1-2能剂量依赖性地显著减少肝转移灶的形成，其疗效与临床药物TAS-102相当，且未引起明显的体重下降，提示其更好的耐受性。LS-1-2还能抑制肿瘤球形成、降低癌症干细胞标志物CD133阳性细胞比例，并下调多种干细胞性和耐药相关基因的表达。

4. 多组学揭示LS-1-2调控FOXO和细胞周期通路： 磷酸化蛋白质组和转录组整合分析发现，LS-1-2处理显著影响了FOXO信号通路和细胞周期相关通路。具体表现为：LS-1-2上调了FOXO通路靶基因（如FBXO32, BNIP3），下调了细胞周期关键调节因子（如PLK1, CDK2, CCNB1）。Western blot验证显示，LS-1-2能抑制EGFR及其下游的ERK和AKT的磷酸化，促进FOXO3a蛋白的表达和核转位，并抑制PLK1、CDK2等细胞周期蛋白的表达。这些结果表明LS-1-2通过抑制致癌信号并激活肿瘤抑制通路发挥作用。

5. LS-1-2的直接分子靶点为非肌肉肌球蛋白重链IIA（Non-Muscle Myosin Heavy Chain IIA, NMHC IIa/ MYH9）： 这是本研究的关键发现。通过生物素探针下拉联合质谱鉴定，将NMHC IIa鉴定为与LS-1-2探针特异性结合的蛋白。CETSA实验证实LS-1–2能直接结合并稳定NMHC IIa。敲低MYH9基因降低了细胞对LS-1-2的敏感性，反之，过表达则增加了敏感性，功能上确认了NMHC IIa是LS-1-2的作用靶点。与经典肌球蛋白II抑制剂blebbistatin不同，LS-1-2不抑制NMHC IIa的ATP酶活性，表明其作用机制独特。

6. LS-1-2通过抑制NMHC IIa的磷酸化发挥作用： 磷酸化蛋白质组学分析发现，LS-1-2处理显著降低了NMHC IIa蛋白上S1714和S1943位点的磷酸化水平。临床数据分析（CPTAC）显示，CRC肿瘤组织中NMHC IIa在S1714和S1943的磷酸化水平显著高于正常组织，且与晚期TNM分期和转移正相关。功能实验表明，过表达野生型NMHC IIa能激活AKT、ERK并抑制FOXO，而模拟非磷酸化的点突变体（S1943A， S1714A）则失去了这种能力，并能抑制癌细胞的增殖和侵袭。这些结果证实NMHC IIa的磷酸化具有促癌功能，而LS-1-2正是通过抑制其磷酸化来发挥作用。

7. LS-1-2抑制磷酸化的分子机制： 分子对接和分子动力学模拟表明，LS-1-2直接结合在NMHC IIa的S1714位点附近，产生空间位阻，直接阻碍了该位点的磷酸化。对于S1943位点（已知可由酪蛋白激酶II Casein Kinase II, CK2 磷酸化），LS-1-2的结合引起了NMHC IIa蛋白构象变化，特别是影响了与CK2α1亚基结合的α螺旋区域，从而变构性地削弱了CK2α1与NMHC IIa的结合亲和力，间接抑制了S1943的磷酸化。实验证实，过表达CK2α1可增强S1943磷酸化，而LS-1-2能逆转此效应。

8. NMHC IIa磷酸化通过Hippo-YAP通路调控下游信号： 机制深入研究发现，NMHC IIa的磷酸化状态影响Hippo通路关键效应因子YAP的活性。野生型NMHC IIa（高磷酸化）抑制YAP磷酸化（即激活YAP），而磷酸化缺陷突变体则促进YAP磷酸化（即抑制YAP）。已知YAP可激活PI3K-AKT和MAPK-ERK通路。因此，LS-1-2通过抑制NMHC IIa磷酸化→抑制YAP活性→进而抑制其下游的AKT和ERK信号，最终导致细胞周期调控蛋白PLK1等的下调，并解除对FOXO肿瘤抑制通路的抑制，共同遏制了KRAS驱动的高转录和肿瘤进展。

9. 临床预后价值： 对患者组织的免疫组化分析显示，NMHC IIa（S1943位点）磷酸化水平高的患者，其总生存期和无病生存期更短，且与肝转移、分化差等不良临床特征相关。

四、 研究结论与意义 本研究得出以下核心结论：KRAS突变型结直肠癌存在“高转录”的分子特征；通过系统性药物筛选，发现了一种新型吖啶衍生物LS-1-2，它能有效抑制KRAS突变型结直肠癌的生长和转移，并克服化疗耐药；LS-1-2的直接分子靶点是NMHC IIa，它通过结合NMHC IIa并抑制其在S1714和S1943位点的磷酸化（直接或通过干扰CK2介导）来发挥药效；NMHC IIa的磷酸化通过激活YAP信号，进而促进PI3K/AKT和MAPK/ERK通路并抑制FOXO通路，驱动肿瘤进展；LS-1-2则逆转这一过程，从而遏制KRAS驱动的致癌表型。

本研究的科学价值在于：首次将NMHC IIa的磷酸化状态与KRAS突变癌症的“高转录”表型和进展直接联系起来，揭示了一个全新的、可操作的信号轴（NMHC IIa / YAP / FOXO-PLK1）。应用价值在于：LS-1-2作为一个全新的临床前候选药物，为治疗目前缺乏有效手段的、难治性KRAS突变型（特别是非G12C）转移性结直肠癌提供了有前景的新策略，并为未来开展相关临床试验提供了理论依据。

五、 研究亮点 1. 研究策略系统且递进：从临床难题出发，构建具临床代表性的难治性模型，进行高通量筛选，并通过化学优化得到先导化合物，再通过多层次、多组学的整合研究深入阐明其药效和分子机制，最后回归临床验证靶点的相关性，形成了一个完整闭环。 2. 新颖的作用靶点与机制：发现了NMHC IIa这一传统上被认为与细胞运动和形态相关的蛋白，其磷酸化在KRAS突变癌症信号传导和转录调控中的全新功能，并阐明了LS-1-2通过独特的变构机制抑制其磷酸化的精确分子细节。 3. 强效的抗肿瘤活性：候选化合物LS-1-2在多种高度难治的临床前模型（包括化疗耐药和放疗后复发转移的PDX模型）中显示出卓越的单药疗效，且能有效抑制肝转移，具备显著的转化潜力。 4. 多学科深度交叉：研究融合了肿瘤生物学、药物化学（化合物设计与合成）、蛋白质组学、生物信息学、计算化学（分子模拟）和临床病理学，是跨学科合作的典范。

六、 其他有价值的内容 研究还观察到LS-1-2能诱导细胞出现一种类似“甲凋亡”的死亡表型（细胞空泡化），这提示除了已阐明的信号通路抑制外，LS-1-2结合NMHC IIa可能还通过破坏细胞膜完整性等机制导致细胞死亡，为理解其强效抗癌作用提供了另一个可能的角度。此外，研究对所有使用的细胞系进行了STR鉴定，确保了实验材料的可靠性，体现了研究的严谨性。