本研究报告针对的是由Ying Zan, Zhijun Dai, Liang Liang, Yujiao Deng 和 Lei Dong（均来自西安交通大学第二附属医院消化科）完成并于2019年在学术期刊《Drug Delivery》上发表的一项原始研究。该研究的论文题目为“Co-delivery of plantamajoside and sorafenib by a multi-functional nanoparticle to combat the drug resistance of hepatocellular carcinoma through reprograming the tumor hypoxic microenvironment”。

一、 研究的学术背景 本研究属于肿瘤靶向治疗与纳米药物递送交叉的前沿领域。其核心科学问题聚焦于克服肝细胞癌对一线靶向药物索拉非尼的耐药性。索拉非尼虽能抑制多种激酶，但其疗效在临床上常因肿瘤药物耐受性、药物在肿瘤组织积累不足以及穿透能力有限而大打折扣。已有研究表明，实体瘤内独特的缺氧微环境是导致肿瘤细胞产生化疗抵抗的关键原因之一，其中缺氧诱导因子HIF-1α的过度表达与耐药性密切相关。

基于此，本研究设定了两个主要目标。第一，利用植物药物与化疗药物的联合治疗策略。研究者选择了车前子苷，一种从中药车前草中提取的天然化合物，前期研究已证明其对多种耐药癌症具有抗癌作用。他们假设，PMS能够通过重编程肿瘤缺氧微环境来克服或减弱HCC对索拉非尼的耐药性。第二，构建一种能够主动靶向肿瘤并实现智能响应释放的多功能纳米递送系统。该系统旨在将PMS和索拉非尼共同递送至肿瘤部位，以解决药物递送效率低下的问题，并最终增强对耐药性肝细胞癌的治疗效果。

二、 详细研究流程 整个研究是一个系统性工程，涵盖了纳米粒的制备与表征、体外细胞实验以及体内动物实验等多个环节，流程设计严谨，层层递进。

1. 多功能纳米粒的制备与表征：

   • 材料与制备：研究首先以mPEG-PLA和Mal-PEG-PLA为材料，采用经典的乳液-溶剂挥发法制备了共负载PMS和索拉非尼的PLA基纳米粒。
   • 功能化修饰：随后，通过马来酰亚胺-巯基反应，将不同的多肽修饰到纳米粒表面，构建了三种功能化纳米粒：仅修饰肿瘤归巢肽CVNHP的CNP-PMS/Sor；仅修饰细胞穿膜肽TAT的TNP-PMS/Sor；以及将CVNHP通过pH敏感性的腙键连接到TAT第4位赖氨酸上形成的复合多肽CT修饰的纳米粒CTNP-PMS/Sor。这种设计是本研究的一个关键创新点，旨在利用正常生理环境与肿瘤酸性微环境的pH差异，实现对TAT穿膜功能的“智能开关”：在血液循环（pH 7.4）中，TAT被“屏蔽”，减少对正常组织的毒性；到达肿瘤部位（pH 6.0）后，腙键断裂，TAT暴露，恢复穿膜能力。
   • 表征内容：对制备的纳米粒进行了全面的物理化学性质表征，包括使用动态光散射测量粒径和电位，透射电镜观察形貌，高效液相色谱法测定药物的包封率和载药量，以及在模拟正常生理和肿瘤微环境的不同pH缓冲液中进行药物释放行为研究。结果显示，CTNP-PMS/Sor粒径约为109纳米，呈球形，具有核心-壳结构，Zeta电位为负值且在血清中稳定，药物释放呈现缓释特性。

2. 体外细胞学研究：

   • 细胞模型建立：研究使用了人肝癌细胞系HepG2，并通过长期低剂量索拉非尼孵育，成功诱导建立了索拉非尼耐药细胞株HepG2/Sor。
   • 细胞摄取实验：将FITC标记的不同纳米粒与HepG2/Sor细胞共孵育，通过流式细胞术和荧光显微镜定性定量分析细胞摄取效率。结果验证了“智能开关”机制：在pH 7.4条件下，CTNP的摄取与CNP相似，显著低于TNP；而在pH 6.0条件下，CTNP的摄取显著提高，接近TNP的水平，表明其pH响应性激活特性。
   • 细胞毒性实验：通过MTT法评估了各种制剂对HepG2/Sor细胞的杀伤作用。结果表明：1) PMS单独使用细胞毒性低；2) 索拉非尼制成纳米粒（NP-Sor）后，细胞毒性优于游离索拉非尼；3) PMS与索拉非尼共载（NP-PMS/Sor）显著增强了后者的细胞毒性，IC50值大幅降低；4) 多肽修饰进一步增强了毒性，其中CTNP-PMS/Sor的IC50值最低，效果最优。
   • 细胞迁移与侵袭实验：通过划痕实验和Transwell小室侵袭实验评估了纳米粒抑制肿瘤细胞转移的能力。结果显示，NP-PMS/Sor比单一药物纳米粒更能抑制细胞的迁移和侵袭，而CTNP-PMS/Sor的抑制效果最强。
   • 机制初步探索：通过Western Blot检测细胞内的蛋白表达。发现PMS能显著降低HepG2/Sor细胞中HIF-1α的蛋白水平，而索拉非尼则能下调增殖细胞核抗原PCNA并上调凋亡蛋白cleaved Caspase-3的水平。这初步揭示了PMS通过调节缺氧微环境关键因子，而索拉非尼通过直接抑制增殖和诱导凋亡来发挥协同作用的可能机制。

3. 体内动物实验：

   • 动物模型建立：将HepG2/Sor细胞皮下接种到BALB/c裸鼠体内，构建耐药肝癌皮下移植瘤模型。
   • 体内分布实验：给荷瘤小鼠静脉注射不同纳米制剂，在不同时间点处死小鼠，采集主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）和肿瘤组织，通过LC-MS/MS检测索拉非尼的浓度。实验结果至关重要：在注射后6小时和12小时，CTNP-PMS/Sor组在肿瘤组织中的药物蓄积量显著高于其他各组（包括TNP组），而在主要正常脏器中的蓄积量却低于TNP组。这直接证明了CT多肽的“智能靶向”优势：它既能像TAT一样高效进入肿瘤细胞，又避免了TAT因缺乏选择性而对正常器官造成的非特异性高摄取。
   • 体内抗肿瘤疗效评价：定期给荷瘤小鼠尾静脉注射不同制剂，监测肿瘤体积、小鼠体重变化，并在实验终点剥离称重肿瘤。Kaplan-Meier生存曲线用于评估小鼠的生存期。结果显示，CTNP-PMS/Sor治疗组的肿瘤生长抑制效果最显著，小鼠生存期最长，且无明显体重下降，表明其高效且相对安全。
   • 肿瘤组织分析：实验结束后，对肿瘤组织进行H&E染色、TUNEL凋亡检测以及HIF-1α的免疫组化染色和Western Blot分析。结果与体外实验一致：CTNP-PMS/Sor组肿瘤细胞凋亡面积最大；PMS能有效降低肿瘤组织内的HIF-1α表达水平；联合治疗（NP-PMS/Sor）比单药治疗（NP-Sor或NP-PMS）更能诱导凋亡和下调HIF-1α，而CT修饰进一步放大了这些效果。

三、 主要研究结果 1. 成功构建了具有pH响应“智能开关”功能的多功能纳米递送系统（CTNP-PMS/Sor）。该系统具备合适的理化性质、缓释特性和稳定的血液相容性。 2. 体外细胞实验证实了协同增效与智能靶向：PMS与索拉非尼共载显著增强了后者对耐药肝癌细胞的杀伤、迁移和侵袭抑制能力。CT多肽的修饰使得纳米粒在体外能根据pH环境智能调控细胞摄取行为，并实现了最佳的细胞毒性效果（最低的IC50值）。 3. 体内实验验证了高效的肿瘤靶向性与卓越的抗肿瘤疗效：药代动力学分布数据强有力地证明，CTNP-PMS/Sor能选择性地在肿瘤部位富集，同时减少在正常组织的暴露。这使得该制剂在荷瘤小鼠体内表现出最强的肿瘤生长抑制作用和最长的生存获益。 4. 机制研究揭示了关键作用通路：分子水平的证据表明，PMS的核心作用在于重编程肿瘤缺氧微环境，即显著下调耐药肿瘤细胞及肿瘤组织中HIF-1α这一关键耐药相关蛋白的表达。这为索拉非尼更好地发挥其抑制增殖（下调PCNA）和诱导凋亡（上调cleaved Caspase-3）的作用扫除了障碍，从而实现了两者的协同。而CT多肽则通过提高药物在肿瘤部位的蓄积和细胞内的穿透，从药代动力学层面放大了这种协同治疗效果。

四、 研究结论与价值 本研究得出的核心结论是：通过构建一种新型的、搭载pH响应性复合多肽CT的纳米共递送系统，成功实现了车前子苷与索拉非尼的协同给药。该策略能够有效重编程肿瘤缺氧微环境（通过PMS下调HIF-1α），并智能增强药物在肿瘤部位的靶向蓄积与细胞穿透（通过CT多肽），从而在体外和体内均显著克服了肝细胞癌对索拉非尼的耐药性，展现出强大的抗肿瘤功效。

其科学价值在于：第一，为克服肿瘤耐药性提供了一个创新的“药物联合+智能递送”一体化解决方案，不仅验证了PMS作为耐药逆转剂的潜力及其通过调节缺氧微环境起作用的新机制，还设计了一种精巧的多肽“屏蔽-激活”策略，解决了细胞穿膜肽TAT靶向性差的经典难题。第二，深化了对天然药物与化疗药物协同作用机制的理解，特别是将中药活性成分的微环境调节功能与现代靶向递送技术相结合，为中药现代化研究提供了范例。

其应用价值在于：该研究所开发的CTNP-PMS/Sor纳米系统具有良好的临床转化前景，为治疗对索拉非尼耐药的中晚期肝细胞癌患者提供了新的潜在候选策略。其设计思路也可推广至其他面临缺氧微环境导致耐药的实体瘤治疗中。

五、 研究亮点 1. 创新的多肽设计：将肿瘤归巢肽CVNHP通过pH敏感的化学键连接到细胞穿膜肽TAT的特定位点，构建了具有“智能开关”功能的CT复合多肽。这是本研究的核心技术亮点，巧妙地将肿瘤微环境的酸性特征转化为药物递送的触发信号。 2. 明确的协同机制阐述：研究不仅证明了PMS能增强索拉非尼的疗效，更通过分子生物学手段深入阐明了其作用机制——即通过下调HIF-1α来重编程肿瘤缺氧微环境，从而逆转耐药。这使得整个研究的逻辑链条非常完整。 3. 系统完整的验证体系：从纳米粒的理性设计、理化表征，到细胞水平的摄取、毒性、迁移侵袭及机制初探，再到动物水平的靶向分布、疗效评价和深入机制验证，研究流程环环相扣，数据相互支撑，论证充分有力。 4. 多学科交叉融合：该研究深度融合了药剂学（纳米递送系统构建）、肿瘤生物学（耐药机制探索）、分子生物学（作用机制研究）以及中药药理学（天然活性成分应用），体现了现代生物医药研究的典型特征。