深度学习赋能的无滤光片荧光显微镜：突破传统成像限制的革命性技术

作者及发表信息
本研究由上海理工大学光学仪器与系统教育部工程研究中心的Bo Dai、Shaojie You团队联合上海交通大学医学院附属仁济医院神经内科的Kan Wang、Yan Guan团队，以及杜克大学机械工程与材料科学系的Tony Jun Huang团队共同完成。研究成果发表于2025年1月的Science Advances（期刊名），标题为《Deep learning–enabled filter-free fluorescence microscope》。

学术背景
荧光显微镜是生物学研究和医学诊断的核心工具，但其依赖光学滤光片（optical filtering sets）分离激发光与发射光，导致系统复杂、体积庞大、成本高昂，且难以实现多通道高速成像。传统滤光片的机械切换速度慢，信号损耗严重。尽管已有时间分辨探测（time-resolved detection）和全光谱照明（full-spectrum illumination）等改进方案，但均存在局限性（如依赖荧光寿命或无法抑制散射背景）。近年来，人工智能技术（如深度学习，deep learning）在显微成像中展现出潜力，但尚未解决荧光信号与激发噪声分离这一根本问题。本研究旨在开发一种基于深度学习的无滤光片荧光显微技术（DL-F3M），通过数字光谱滤波（digital spectral filtering）实现高精度荧光预测。

研究流程
1. 系统设计与原理
- 光学架构：DL-F3M采用倾斜照明（angled illumination，入射角β=72°）减少激发光进入物镜，利用彩色相机（如Bayer滤光阵列）直接捕获荧光与散射混合信号。
- 神经网络设计：
- 荧光通道选择网络（NetFCS）：基于MobileNetV2框架的概率神经网络，自动识别输入图像所属荧光通道（如370/450 nm、480/520 nm等）。
- 数字光谱滤波网络：采用生成对抗网络（GAN，如Pix2Pix-GAN）架构，包含残差网络（residual network）和跨阶段局部网络（cross stage partial network），用于从原始图像中重构荧光信号。

1. 数据训练与验证

   • 训练样本：
     
     • 细胞模型：HEK293T细胞（转染GFP/tdTomato）、4T1乳腺癌细胞（DAPI/Calcein-AM染色）、Balb/3T3成纤维细胞（TGF-β1诱导转化）。
       
     • 组织样本：人食管癌组织（DAPI/TSA多重标记）、人肝组织（FITC/Cy3标记）。
       
   • 实验方法：
     
     • 使用不同放大倍数物镜（5×/0.13 NA、20×/0.40 NA）采集图像，覆盖多种荧光标记浓度（0.25–2 μg/mL）和激发功率（32.6–146.2 mW/cm²）。
       
     • 对比传统荧光显微镜（配备滤光片组）与DL-F3M的成像结果，评估灵敏度（sensitivity）、特异性（specificity）和结构相似性（SSIM）。
       

2. 创新性方法

   • 数字光谱滤波算法：通过计算斯托克斯位移（Stokes shift）导致的颜色变化，区分荧光与散射噪声。
     
   • 持续学习（continual learning）技术：支持新增荧光通道的快速适配，仅需少量训练数据。
     

主要结果
1. 细胞成像性能
- HEK293T细胞的Hoechst染色预测灵敏度达100%，GFP和tdTomato的灵敏度分别为93.7%和96.3%，特异性均为100%。误差图（error maps）显示预测结果在位置、形态和荧光强度上与金标准高度一致（SSIM>0.87）。
- 低浓度（0.25 μg/mL）Calcein-AM染色细胞仍能准确预测（信噪比>10 dB），证实DL-F3M对弱信号的捕捉能力。

1. 组织成像应用

   • 人食管癌组织的五重荧光标记（DAPI/CD3/CD4/CD8/Vimentin）中，DL-F3M成功分离光谱重叠的通道（如TSA520与TSA570），定位特异性蛋白表达。
     
   • 肝组织中的α-SMA（FITC标记）和内皮细胞（Cy3标记）预测结果与病理诊断一致，支持定量分析（如成纤维细胞转化后α-SMA表达量提升4.2倍）。
     

2. 技术扩展性

   • 新增荧光通道（如量子点标记）仅需更新NetFCS和对应的滤波网络，无需硬件改动。远程批量升级（remote batch upgrades）可实现多设备同步更新。
     

结论与价值
1. 科学价值：
- 首次实现无滤光片的荧光显微成像，解决了传统技术中机械切换慢、信号损耗高的瓶颈问题。
- 深度学习模型揭示了荧光发射与散射噪声的关联性，为计算光学成像（computational optical imaging）提供了新范式。

1. 应用价值：
   
   • 生物医学工具：可集成至流式细胞仪（flow cytometry）、内窥镜（endoscopy）等设备，降低多通道检测成本。
     
   • 临床诊断：支持快速多重免疫荧光（multiplexed immunofluorescence）分析，助力肿瘤微环境研究。
     

研究亮点
1. 方法创新：
- 结合倾斜照明与深度学习，取代物理滤光片，系统复杂度降低50%以上。
- 提出“数字光谱滤波”概念，突破传统荧光分离的物理限制。

1. 性能优势：
   
   • 高速成像：LED光源切换时间达微秒级，图像处理速度（1.5兆像素）<110毫秒。
     
   • 通用性强：适用于细胞、组织及运动样本（如悬浮细胞追踪）。
     

其他价值
- 开源潜力：研究未公开代码，但算法框架（如Pix2Pix-GAN）可复用于其他显微成像场景。
- 跨学科影响：为计算生物学（computational biology）和智能医疗器械开发提供新思路。

（注：术语首次出现时保留英文原词，如“Stokes shift”译为“斯托克斯位移”。）