本研究题为《FAM84B acts as a tumor promoter in human glioma via affecting the AKT/GSK-3β/β-catenin pathway》，由王敏娟、李成亮及石伟共同完成。王敏娟来自西安交通大学第二附属医院神经外科与西安医学院第一附属医院神经内科；李成亮来自西安医学院第一附属医院全科医学科；石伟为西安交通大学第二附属医院神经外科的通讯作者。该研究成果发表于期刊《Biofactors》，于2021年3月接受发表。
这项研究属于肿瘤学与分子生物学交叉领域，聚焦于神经胶质瘤的发病机制与潜在治疗靶点的探索。胶质瘤是最常见且最具侵袭性的脑部恶性肿瘤，其高复发率与转移性导致患者预后极差，目前尚缺乏高效的治疗手段。因此，深入阐明其发生发展的分子机制、寻找新的治疗靶点具有紧迫的科学和临床意义。研究团队注意到，序列相似性家族84成员B（FAM84B）基因位于染色体8q24.21区域，该区域在多种癌症中频繁扩增，且已有研究表明FAM84B在如前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种实体瘤中扮演癌蛋白的角色，其高表达与不良预后相关。然而，FAM84B在胶质瘤中的表达模式、功能角色及其作用机制尚不明确。此外，Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路在胚胎发育和肿瘤发生中至关重要，其异常激活已知参与胶质瘤的进展。考虑到8q24.21区域扩增也与胶质瘤易感性相关，研究团队推测FAM84B可能在胶质瘤中同样失调，并通过调节某个关键通路来促进肿瘤发展。基于此，本研究的明确目标是：评估FAM84B在胶质瘤中的表达情况，探究其表达水平与患者预后的关联，并通过体外和体内实验系统揭示FAM84B对胶质瘤细胞恶性行为（增殖、凋亡、侵袭）的影响及其背后的分子机制，特别是其与AKT/GSK-3β/β-catenin通路的关系。
研究的详细工作流程涉及多个连续的实验程序。首先，研究人员利用公共数据库和临床样本进行了FAM84B表达谱分析。他们通过在线数据库GEPIA分析了163例胶质瘤组织和207例正常脑组织中FAM84B的mRNA表达水平。同时，收集了5例胶质瘤患者的新鲜冷冻肿瘤组织和5例正常脑组织作为对照。使用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测mRNA水平，并使用蛋白质印迹法（Western blotting）检测蛋白水平。此外，利用另一个在线数据库Prognoscan，分析FAM84B表达水平与胶质瘤患者总体生存率之间的相关性，并进行Kaplan-Meier生存分析。在此阶段，没有使用自创的、特殊的实验方法或设备，均是分子生物学和生物信息学领域的标准操作。数据分析采用了标准的2−ΔΔCt法进行RT-qPCR数据定量，使用GraphPad Prism 8软件进行统计分析，组间差异采用Student’s t检验或方差分析及事后检验，p值小于0.05视为具有统计学意义。
其次，研究团队进行了体外细胞功能实验，以探究FAM84B在胶质瘤细胞中的功能。他们选用了四株胶质瘤细胞系（LN-229, SHG-44, U87, U251）和一株正常人星形胶质细胞系HA1800，通过RT-qPCR和Western blotting验证了FAM84B在不同胶质瘤细胞系中的高表达情况。基于表达水平，他们选择了U87和U251细胞系进行后续的增益功能与减损功能实验。为了敲低FAM84B，研究者将FAM84B的短发夹RNA（shRNA）构建体克隆到plKO.1载体中，并瞬时转染到U87和U251细胞中，同时设置转染乱序scrambled shRNA的阴性对照组。为了过表达FAM84B，他们将FAM84B的cDNA编码区序列克隆到pcDNA3.1载体中，并瞬时转染到细胞中，使用空载体作为对照。转染效率通过RT-qPCR和Western blotting进行验证。随后，一系列功能实验随之展开。细胞增殖能力通过CCK-8试剂盒检测细胞在450 nm处的吸光度（OD值）来评估；克隆形成能力通过平板克隆形成实验，即接种单细胞悬液培养14天后计数形成的克隆团来评估；细胞凋亡率通过流式细胞术，使用Annexin V-FITC和PI双染色法检测；细胞侵袭能力则通过Transwell小室侵袭实验评估，上室铺有Matrigel基质胶，下室含血清作为趋化因子，培养24小时后对穿过基质的细胞进行染色和计数。这些均为细胞功能研究的经典方法。
第三，为了探索FAM84B影响胶质瘤细胞行为的分子机制，研究团队将重点放在了Wnt/β-catenin信号通路上。他们通过Western blotting检测了FAM84B敲低或过表达后，细胞内活性β-catenin（非磷酸化稳定形式）蛋白水平的变化。同时，利用TCF/LEF荧光素酶报告基因实验来定量检测该信号通路的转录活性。为了探究FAM84B如何调控β-catenin的活性，他们进一步检测了该通路上游关键激酶的状态：通过Western blotting检测了磷酸化AKT（p-AKT，即激活状态的AKT）和磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β，即失活状态的GSK-3β）的水平。为了确认AKT在FAM84B调控通路中的核心作用，他们使用了AKT抑制剂GSK690693（5 μM）处理过表达FAM84B的胶质瘤细胞，然后再次检测p-GSK-3β、活性β-catenin水平以及TCF/LEF报告基因活性，并评估其对细胞增殖和侵袭能力的影响。此外，为了验证FAM84B的作用是否确实通过Wnt/β-catenin通路介导，他们进行了“拯救实验”。一方面，在敲低FAM84B的同时，共转染β-catenin表达质粒来重新激活该通路，观察是否能逆转敲低FAM84B对细胞增殖和侵袭的抑制作用。另一方面，在过表达FAM84B的同时，使用Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939（20 μM）处理细胞，观察是否能消除过表达FAM84B对细胞增殖和侵袭的促进作用以及对TCF/LEF活性的增强效应。
第四，为了在活体环境中验证FAM84B的促瘤作用，研究进行了体内皮下移植瘤实验。他们构建了稳定表达FAM84B shRNA（sh-FAM84B）或对照shRNA（sh-scrambled）的U87细胞系。将等量的两种细胞分别皮下接种到5-6周龄的BALB/c裸鼠（每组3只）的背部两侧。当可触及肿瘤后，定期用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积（公式：长×宽^2/2），并绘制生长曲线。实验结束后，剥离肿瘤称重。最后，取肿瘤组织进行蛋白质印迹分析，检测其中FAM84B、p-AKT、p-GSK-3β和活性β-catenin的蛋白表达水平。
研究的主要结果系统且有力地支持了研究假设。在表达谱分析阶段，GEPIA数据库分析和临床样本检测均一致显示，与正常脑组织相比，胶质瘤组织中的FAM84B mRNA和蛋白水平均显著升高。生存分析进一步揭示，FAM84B高表达的胶质瘤患者总体生存率显著低于低表达患者，表明FAM84B是一个潜在的预后不良指标。在体外功能实验中，Western blotting和RT-qPCR证实了转染sh-FAM84B能有效降低U87和U251细胞中FAM84B的表达。功能检测结果明确显示：敲低FAM84B显著抑制了胶质瘤细胞的增殖（CCK-8 OD值降低）和克隆形成能力（形成的克隆团数量减少），同时诱导了细胞凋亡（Annexin V+/PI-和Annexin V+/PI+细胞比例增加），并削弱了细胞的侵袭能力（穿过Matrigel的细胞数减少）。相反，过表达FAM84B则产生了完全相反的效果：促进了细胞的增殖、克隆形成和侵袭，并抑制了细胞凋亡。这些结果逻辑清晰地表明FAM84B在胶质瘤细胞中发挥着癌基因的功能，促进恶性表型。
在机制探索方面，分子生物学检测结果揭示了FAM84B的作用途径。敲低FAM84B显著降低了胶质瘤细胞中活性β-catenin的蛋白水平和TCF/LEF报告基因的活性；而过表达FAM84B则显著增加了这两项指标。这表明FAM84B正调控Wnt/β-catenin信号通路。进一步的上游分析发现，敲低FAM84B降低了p-AKT和p-GSK-3β的水平；过表达FAM84B则提高了它们的水平。这提示FAM84B可能通过激活AKT，进而磷酸化并抑制GSK-3β（因为GSK-3β被磷酸化后失活），从而阻止了GSK-3β对β-catenin的磷酸化和降解，最终导致β-catenin稳定积累并激活下游转录。关键性的验证实验支持了这一机制：使用AKT抑制剂处理后，FAM84B过表达所引起的p-GSK-3β和活性β-catenin水平升高、TCF/LEF活性增强、细胞增殖和侵袭能力提升等效应均被显著逆转甚至消除。这直接证明了AKT是FAM84B激活下游通路的关键节点。此外，拯救实验提供了更强有力的因果证据：当在敲低FAM84B的同时重新过表达β-catenin，可以逆转敲低FAM84B对细胞增殖和侵袭的抑制作用；而当用XAV-939抑制Wnt/β-catenin通路时，可以消除过表达FAM84B对细胞增殖和侵袭的促进作用。这些结果在逻辑链上完整地证实了“FAM84B → AKT激活 → GSK-3β磷酸化（失活）→ β-catenin稳定/激活 → 促进胶质瘤恶性行为”这一分子轴。
体内实验的结果完美地印证了体外发现。接种了稳定敲低FAM84B的U87/sh-FAM84B细胞的裸鼠，其皮下肿瘤的生长速度明显慢于接种对照细胞的裸鼠，最终形成的肿瘤体积更小、重量更轻。对肿瘤组织的分析显示，U87/sh-FAM84B组肿瘤中的FAM84B蛋白水平降低，同时p-AKT、p-GSK-3β和活性β-catenin的蛋白水平也均显著下降。这些体内数据不仅证实了FAM84B对胶质瘤生长的促进作用，还将体外发现的信号通路调控机制延伸到了复杂的活体微环境中，极大地增强了研究结论的说服力。
本研究得出明确结论：FAM84B在人类胶质瘤中作为一种肿瘤促进因子发挥作用。其机制是通过激活AKT，导致GSK-3β磷酸化失活，从而稳定β-catenin并激活经典的Wnt/β-catenin信号通路，最终驱动胶质瘤细胞的增殖、侵袭，并抑制其凋亡。敲低FAM84B则能产生显著的抗肿瘤效果。该研究的科学价值在于首次系统阐明了FAM84B在胶质瘤中的致癌功能及其具体的分子作用机制，为胶质瘤的分子病理学增添了新的重要认识。其应用价值则在于，FAM84B不仅是一个潜在的胶质瘤预后生物标志物，更因其明确的促癌功能和可靶向性（通过shRNA敲低有效），而成为一个有前景的抗胶质瘤治疗新靶点，为未来开发基于靶向FAM84B或其下游信号通路的疗法提供了坚实的实验依据和理论框架。
本研究的亮点突出。首先，研究发现具有创新性：这是首次将FAM84B与胶质瘤的恶性进展直接联系起来，并完整揭示了一条新的“FAM84B-AKT-GSK-3β-β-catenin”信号调控轴，为理解胶质瘤的发病机制提供了新视角。其次，研究设计系统且严谨：工作流程从数据库挖掘、临床样本验证，到体外细胞功能与机制探索，再到体内动物模型验证，构成了一个完整、闭环的证据链。特别在机制研究中，不仅进行了相关性观察（检测蛋白水平变化），还通过药理学抑制剂阻断（AKT抑制剂）和遗传学拯救实验（β-catenin回补与通路抑制剂），建立了明确的因果关系，论证力度强。第三，研究结果具有明确的转化潜力：FAM84B作为8q24.21扩增区的产物，其致癌功能的确认及其与患者不良预后的关联，使其兼具诊断和潜在治疗靶点的双重价值。此外，研究也提及了关于FAM84B功能的复杂性，指出在其他一些癌症（如胃食管交界部癌）中可能存在抑癌作用，这提示其功能可能具有组织或癌症类型特异性，为未来更广泛的研究留下了空间。