这篇研究发表于2024年9月26日的《International Journal of Molecular Sciences》期刊上，由斯洛文尼亚卢布尔雅那大学医学院生物物理研究所的Jernej Repas、Tjaša Frlic、Tadeja Snedec、Mojca Pavlin以及来自斯洛文尼亚卢布尔雅那大学微生物与免疫学研究所、奥地利格拉茨医科大学、斯洛文尼亚卢布尔雅那大学医学中心临床内分泌、糖尿病与代谢疾病科等多个研究机构的合作者共同完成。

本研究的学术背景聚焦于癌症免疫治疗与细胞代谢的交叉领域。以T细胞为核心的免疫疗法，如嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞和免疫检查点抑制剂，已成为肿瘤治疗的重要突破。然而，仍有大量患者对现有疗法无应答，因此寻找改善T细胞抗肿瘤应答的新策略至关重要。肿瘤微环境的一个关键特征是癌细胞的有氧糖酵解增强（即“瓦博格效应”），这不仅支持肿瘤生长，还可能导致葡萄糖耗竭并抑制浸润T细胞的功能。2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose, 2DG）是一种葡萄糖类似物，因其能抑制糖酵解和蛋白质N-糖基化而被视为具有潜力的抗癌药物和免疫调节剂。前期研究表明，2DG能通过减少肿瘤细胞表面程序性死亡配体-1（Programmed Death-Ligand 1, PD-L1）和T细胞表面程序性死亡受体-1（Programmed Death-1, PD-1）的糖基化来间接增强抗肿瘤免疫。然而，2DG作为糖酵解抑制剂，也可能直接抑制T细胞的功能，特别是关键效应细胞因子γ干扰素（Interferon-γ, IFN-γ）的分泌。此前许多体外研究使用了较高浓度（≥2 mM）的2DG，而临床上患者血浆中可安全达到的浓度约为0.6 mM。此外，2DG处理的时间点（相对于T细胞激活）也可能影响其结果。因此，本研究旨在探究低剂量（生理可达到浓度）、短时程的2DG处理对从人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）分离的活化T细胞中IFN-γ分泌的影响，并阐明其潜在作用机制。

研究的工作流程详尽，主要分为七个部分。首先，研究者从健康供体的PBMCs中分离T细胞，并设计了两种关键的处理时序：1）与激活同时处理：在T细胞使用抗CD3/抗CD28抗体激活的同时，加入不同浓度的2DG（0.6 mM或4.8 mM）处理72小时。2）激活后处理：T细胞先使用抗CD3/抗CD28抗体激活48小时，洗涤去除刺激物后，再使用不同浓度（0.15 - 4.8 mM）的2DG处理24小时或72小时，处理后再用佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA）和离子霉素（Ionomycin）进行4小时的再刺激以最大化细胞因子分泌。研究涉及的样本主要来自多名健康供体的PBMCs或分离的T细胞，实验重复3-7次以确保结果的稳健性。其次，除了原代T细胞，研究还使用了Jurkat T细胞系（包括直接来自ATCC的克隆和另一个能分泌更多IFN-γ的克隆）作为补充模型。第三，在机制探究部分，研究团队引入了多种共处理试剂：使用外源甘露糖（Mannose）来竞争性恢复被2DG抑制的蛋白质N-糖基化；使用腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）抑制剂Compound C和激活剂A 769662来探究AMPK通路的作用；使用雷帕霉素（Rapamycin）抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of Rapamycin, mTOR）通路；使用衣霉素（Tunicamycin）作为另一种蛋白质N-糖基化抑制剂进行对照。第四，研究采用了多种实验技术进行多维度的分析：使用酶联免疫吸附测定（ELISA）定量细胞培养上清中的IFN-γ和白细胞介素-2（Interleukin-2, IL-2）浓度；使用流式细胞术检测T细胞表面激活标志物CD69、抑制性检查点PD-1的表达，以及细胞内转录因子T-bet、Eomes、磷酸化核糖体蛋白S6（p-S6RP）的水平。第五，使用海马（Seahorse）细胞能量代谢分析仪实时测量细胞的细胞外酸化率（Extracellular Acidification Rate, ECAR，代表糖酵解）和氧消耗率（Oxygen Consumption Rate, OCR，代表氧化磷酸化），以评估2DG对T细胞能量代谢的影响。第六，对2DG处理后的T细胞进行RNA测序（RNA-seq）转录组分析，以全面了解基因表达的变化，特别是与内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER Stress）、未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）和IFN-γ信号通路相关的基因。第七，数据统计分析采用重复测量单因素或双因素方差分析（ANOVA），并进行适当的事后检验（如Dunnett’s或Šidák’s test），以评估处理组与对照组之间的显著性差异。整个工作流程逻辑严谨，从表型观察到机制深挖，逐步推进。

研究的主要结果丰富且具有启发性。第一，在激活后处理的模型中，2DG对IFN-γ的分泌表现出明显的毒物兴奋效应（Hormetic Effect）。具体而言，低浓度（0.15-0.6 mM）的2DG处理能显著增加IFN-γ的分泌，其中0.6 mM 2DG处理24小时可使IFN-γ水平增加150%-175%，处理72小时效果更显著（增加约200%）。然而，当浓度超过1.2 mM时，IFN-γ的分泌开始呈现剂量依赖性的下降。与此形成鲜明对比的是，IL-2的分泌随着2DG浓度的增加而呈现单调下降。这一结果首次明确揭示了在生理可达到的低剂量下，短时程2DG处理能特异性地上调原代人T细胞的IFN-γ产生。第二，在与激活同时处理的模型中，即使使用0.6 mM的低剂量2DG，也未能增加IFN-γ的分泌，反而有降低趋势，而4.8 mM的高剂量则几乎完全抑制了IFN-γ的分泌。这凸显了处理时机是决定2DG对T细胞功能产生刺激还是抑制效应的关键因素。第三，在细胞表型方面，无论处理时机如何，低剂量2DG（0.6 mM）均能降低PD-1的表达（在CD4+ T细胞中尤为显著）并增加早期激活标志物CD69的表达。在激活后处理模型中，流式细胞术分析显示，0.6 mM 2DG主要增加了CD69+ PD-1- 的T细胞亚群比例，这被认为是一种更有利于效应功能的表型。第四，在机制探索中，研究发现外源甘露糖能部分（在PBMCs中）或完全（在Jurkat克隆中）阻断2DG引起的IFN-γ增加，并能逆转2DG对PD-1表达的降低作用，提示抑制蛋白质N-糖基化至少部分介导了2DG的免疫调节效应。然而，使用AMPK抑制剂Compound C或激活剂A 769662的实验表明，AMPK通路的激活并非IFN-γ增加的必要条件。同样，mTORC1通路抑制剂雷帕霉素未能模拟2DG的效果，且2DG处理对p-S6RP水平影响不大，排除了mTOR通路的核心作用。第五，能量代谢分析显示，0.6 mM 2DG处理使活化T细胞的糖酵解（ECAR）部分降低，而氧化磷酸化（OCR）未受显著影响，导致OCR/ECAR比率显著升高，总ATP产量维持不变。这表明低剂量2DG诱导了代谢重编程，从糖酵解为主部分转向了氧化代谢，且这一转变不受甘露糖影响，说明其独立于糖基化抑制，可能与糖酵解的直接抑制有关。第六，对转录因子和基因表达的分析提供了更深入的机制线索。流式细胞术显示，2DG处理并未增加关键IFN-γ转录因子T-bet和Eomes的蛋白表达，甚至T-bet+细胞比例有轻微下降趋势。RNA-seq数据进一步证实，IFNG基因本身的转录水平并未因2DG处理而显著上调。这一关键发现表明，IFN-γ分泌的增加并非源于转录水平的提升。然而，转录组分析清晰地揭示了2DG处理以剂量依赖的方式诱导了内质网应激和未折叠蛋白反应。0.6 mM 2DG处理即可上调多个UPR相关基因（如ATF4, XBP1）以及内质网伴侣蛋白基因（如HSPA5, CALR, PDIA6, PDIA4）的表达。这些伴侣蛋白正是IFN-γ在内质网中正确折叠和分泌所必需的。综合这些结果，研究提出了一个合理的假设模型：低剂量、短时程的2DG处理通过抑制蛋白质N-糖基化（可能也涉及轻微的糖酵解抑制）引发了适度、可控的内质网应激，进而激活UPR。UPR导致内质网伴侣蛋白的表达上调，从而增强了内质网对IFN-γ等分泌蛋白的折叠能力。当T细胞随后被再刺激时，这种增强的折叠能力促进了更多预先转录好的IFN-γ mRNA的有效翻译和后处理，最终导致分泌增加。而高剂量2DG引发的强烈糖酵解抑制和/或过度内质网应激则压倒性地抑制了IFN-γ的合成与分泌。

本研究的结论具有重要的科学意义和应用价值。其主要结论是：低剂量（生理可达到浓度，≤0.6 mM）、短时程的2DG处理，在T细胞激活之后（而非同时）给予，能够特异性且显著地增强人原代T细胞的IFN-γ分泌能力，同时降低其PD-1表达。这种效应呈现毒物兴奋性剂量关系，其机制可能涉及2DG抑制蛋白质N-糖基化所诱导的适度内质网应激和UPR，进而通过增加内质网伴侣蛋白的表达来增强IFN-γ的折叠与分泌，而非通过上调其转录。 这项研究的科学价值在于：1）澄清了争议：通过系统性地控制浓度和处理时序，为文献中关于2DG对T细胞功能看似矛盾的结果（抑制 vs. 增强）提供了合理解释。2）揭示了新机制：首次将低剂量2DG对T细胞IFN-γ产生的刺激作用与适度内质网应激及UPR诱导联系起来，并提出了一种不依赖于转录上调的、基于翻译后加工能力增强的新调控模式。3）拓展了认知：强调了在评估代谢调节剂对免疫细胞功能影响时，剂量、时长和处理时序的极端重要性。其应用价值则体现在为癌症联合免疫治疗提供了新思路：低剂量2DG作为一种口服或注射给药的辅助手段，与传统免疫检查点抑制剂（如抗PD-1/PD-L1抗体）联用，有可能在体内同时实现降低T细胞耗竭标志物（PD-1）和增强效应功能（IFN-γ） 的双重收益，从而可能改善对现有疗法无应答患者的预后。此外，该发现也为优化过继性细胞疗法（如CAR-T）的体外培养方案提供了参考。

本研究的亮点突出：首先，重要的发现：明确揭示了低剂量2DG在特定时序下对原代人T细胞IFN-γ分泌的刺激作用及其毒物兴奋效应，并发现了IFN-γ增加不依赖于转录上调这一反直觉的现象。其次，研究设计的新颖性：系统性地比较了“同时处理”与“激活后处理”两种时序，并综合运用了生理相关浓度，这使其结论更具生理和临床参考价值。第三，机制探究的深度与多维性：研究并未停留在表型描述，而是通过代谢分析、药理干预、转录组学等多层次技术手段，深入挖掘了潜在机制，最终聚焦于内质网应激和UPR这一相对新颖的角度，构建了逻辑自洽的假设。第四，明确的临床转化启示：研究结果直接指向了将低剂量2DG作为免疫治疗辅助剂的潜在临床应用，具有清晰的转化医学意义。此外，研究中对PD-1和CD69共表达亚群的分析，以及对Jurkat细胞不同克隆间差异的观察，也提供了有价值的额外信息。