本文属于类型a，即单一原创研究报告。以下是对该研究的详细学术报告。
该研究由南京林业大学化学工程学院先进生物医学材料联合实验室（joint laboratory of advanced biomedical materials，NFU-UGent）的渠清丽、张筱丽以及中国科学院兰州化学物理研究所的裴栋、南京市儿童医院程维霞等多位研究人员合作完成。通讯作者为程维霞、裴栋和黄超伯。渠清丽和张筱丽为该论文的共同第一作者。该研究于2024年8月28日在线发表于国际期刊《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》第244卷，文献编号114184。
随着抗生素耐药菌和生物膜日益增多，协同治疗策略近年来受到广泛关注。化疗（chemotherapy）、光热疗法（photothermal therapy，PTT）和光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是临床上最常见的治疗手段。其中，光热疗法通过特定波长照射产生局部高温杀灭细菌，光动力疗法则通过活性氧（reactive oxygen species，ROS）破坏细菌结构。然而，很多协同治疗剂设计过于复杂，且部分使用了未经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的成分。
纤维素作为常用的药物辅料，能够实现药物的控制释放，同时也易被褐腐真菌产生的活性氧降解。褐腐真菌是自然界中木材的主要降解真菌之一，与其他利用纤维素酶系统分解纤维素的丝状真菌不同，褐腐真菌采用独特的非酶促途径，通过产生GT-螯合剂（gt-chelator），利用活性氧促进纤维素降解而不损伤木质素。受褐腐真菌功能的启发，本研究开发了一种结合光动力疗法的药物控释新策略，不采用复杂合成方法和未经FDA批准的成分。普鲁士蓝（prussian blue，PB）是FDA批准的临床常用制剂，含有低自旋的Fe²⁺和高自旋的Fe³⁺，具有模拟褐腐真菌含铁GT-螯合剂的可能性，同时具备良好的光热转换能力和类芬顿（Fenton-like）反应器特性，可支持光热疗法和光动力疗法的协同发展。因此，本研究旨在利用气体剪切法（gas-shearing method）制备仿生羟乙基纤维素@普鲁士蓝微粒（hydroxyethyl cellulose @ prussian blue microparticles，HEC@PB MPs），并探索其抗生素-光热-光动力三模态协同抗菌及生物膜清除效果。
研究者采用气体剪切微流控技术（gas-shearing microfluidics）一步制备HEC@PB MPs。制备装置由三根同轴针头组成：内针（30G）输送由0.5%海藻酸盐（alginate，alg）和2%羟乙基纤维素（hydroxyethyl cellulose，HEC）组成的混合溶液作为内相；中针（23G）输送含有K₄Fe(CN)₆的海藻酸盐溶液作为外相；外针（14G）输送气体。内相和外相分别以0.1 mL/h和1 mL/h的流速由微量注射泵注入，同时6 L/min的气流施加剪切力将液滴切割。收集浴为2% FeCl₃和3%壳聚糖（chitosan，cs）的水溶液（体积比9：1）。根据K₄Fe(CN)₆浓度不同制备了三种微粒：MP1（0.01 mol/L）、MP2（0.02 mol/L）和MP3（0.04 mol/L）。由于Fe³⁺浓度远高于Fe(CN)₆⁴⁻，PB浓度可近似按Fe(CN)₆⁴⁻计，估算MP1、MP2和MP3中PB（FeIII₄[FeII(CN)₆]₃·xH₂O）浓度分别为3.03 mmol/L、6.06 mmol/L和12.12 mmol/L。微粒采用Olympus IX53显微镜成像。
将200个微粒分散于1 mL磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS，pH 7.4）中，以808 nm激光（1.2 W cm⁻²）照射，用875–1i红外相机（testo，德国）记录温度变化和热成像图。PBS溶液在相同条件下作为对照。通过升温-降温循环（四个循环）评价光热稳定性，并根据降温阶段数据计算光热转换效率。
采用紫外-可见分光光度计监测ROS生成。以亚甲基蓝（methylene blue）为指示剂，将200个微粒、200 μL 3% H₂O₂和3 mL亚甲基蓝溶液混合，在预定时间点测定630 nm处吸光度。同时以1,3-二苯基异苯并呋喃（1,3-diphenylisobenzofuran，DPBF）为探针，监测410 nm处吸光度变化评估ROS产生。
以四环素（tetracycline）为模型药物，将约300个MP3（内相含0.5% alg、2% HEC和50 mg mL⁻¹四环素）洗涤后浸入10 mL释放介质（PBS，pH 7.4，分别含0、30、60、90 μL 3% H₂O₂），记录358 nm处吸光度评价药物释放动力学。
以大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli，ATCC 25922）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus，ATCC 25923）为研究对象，过夜培养后设置六组：阴性对照组、PTT组（微粒无四环素+808 nm激光照射5 min）、CDT组（微粒无四环素+100 μL 3% H₂O₂）、CT组（含四环素海藻酸盐微粒）、TH组（游离四环素）和PTT/CDT/CT联合治疗组（含四环素微粒+H₂O₂+激光照射）。通过测定600 nm处光密度值（OD600）进行增殖试验，CFU计数法（colony forming unit，cfu）评价杀菌活性，扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）观察细菌结构完整性，Bradford法测定蛋白泄漏（630 nm处吸光度），结晶紫染色法（crystal violet staining）评价生物膜降解（570 nm处吸光度）。
将200个微粒浸泡于1 mL DMEM培养基72 h制备浸提液，以L929小鼠成纤维细胞为对象，采用MTT法测定细胞活力（492 nm处吸光度）。溶血试验中，将红细胞与含20个微粒的PBS共孵育1 h，以Triton X-100为阳性对照，PBS为阴性对照，测定540 nm处上清液吸光度计算溶血率。
光学显微镜显示HEC@PB MPs呈典型的核壳结构，粒径分布范围为439.03–577.53 μm（平均粒径505.22 μm，n = 100），具有良好的单分散性（标准差SD = 31.23 μm，变异系数CV = 6.18%）。SEM图像显示微粒整体形态类似红细胞，表面附着有颗粒状物质，推测为普鲁士蓝。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析显示，1402 cm⁻¹和1637 cm⁻¹处为-COO-的对称和不对称伸缩振动峰，3444 cm⁻¹处为N-H和O-H伸缩振动峰，证实cs、HEC和alg的存在；1045 cm⁻¹处为HEC的C-O-C伸缩振动特征峰，2080 cm⁻¹处为普鲁士蓝的C≡N键特征峰。X射线光电子能谱（XPS）分析进一步确认了氮、碳和铁元素的存在，C 1s谱显示C-C（284.2 eV）、C-O（285.7 eV）和C=O（288.1 eV）的贡献，N 1s谱拟合出-NH⁺（397.2 eV）、-NH₂（399.6 eV）和CO-N（401.8 eV）三种峰，证明cs和alg通过静电作用形成大分子网络。Fe 2p谱中711.4 eV和722.4 eV处的峰分别归属于Fe 2p₃/₂和Fe 2p₁/₂，确认了与PB相关的Fe²⁺基团。
不同PB浓度的微粒在808 nm激光照射下均能有效将光能转化为热能。MP1悬浮液温度从26.3 ℃升至60.9 ℃（ΔT = 34.6 ℃），MP2迅速升至63.0 ℃（ΔT = 37.0 ℃），MP3升至67.0 ℃（ΔT = 37.8 ℃），但三者差异无统计学意义（p>0.05）。MP3的光热转换效率（η）为28.27%。四次循环加热/冷却曲线显示最高温度相似，表明其光热稳定性良好。PB在近红外区（650–900 nm）的强吸收源于Fe²⁺到Fe³⁺的金属间电荷转移或价间带跃迁。
DPBF和亚甲基蓝探针的吸光度变化表明，PB浓度越高的微粒产生的ROS越多，具备光动力疗法的潜力。FT-IR结果显示HEC在微粒处理前后化学键无明显变化，但流变学性质发生显著改变，处理后的HEC粘度明显降低，证实ROS（通过PB与H₂O₂的类芬顿反应产生）成功降解了HEC。这些结果表明PB微粒有效模拟了褐腐真菌对纤维素的降解功能，PB可作为GT-螯合剂的类似物。
四环素标准曲线为y = 0.0317x + 0.0176（r² = 0.9993）。在含H₂O₂的释放介质中，四环素从微粒中快速释放，且H₂O₂浓度越高，药物释放越完全；而在纯PBS中，微粒在20 min内几乎不释放药物。这验证了仿生触发性药物释放机制的有效性。
增殖试验显示，单一治疗模式下，仅PTT对E. coli显示一定抗菌活性（54 h时抑制率为33.53%），单一PDT对S. aureus有较好的抗菌效果（54 h时抑制率为65.64%）。而三模态联合治疗后细菌量显著下降，E. coli 54 h抑制率达77.60%，S. aureus达84.41%。值得注意的是，PDT处理的S. aureus在66 h后OD600值上升，120 h时抑制率降至37.33%，而三模态治疗组在相同时间点的抑制率仍保持在80.15%，表明三模态疗法具有更持久的抗菌效果。CFU计数结果显示三模态治疗组几乎无菌落形成，SEM图像显示细菌结构不完整，证实了微粒通过破坏细胞膜通透性发挥杀菌作用。蛋白泄漏试验中，630 nm处OD值的升高进一步印证了膜损伤机制。生物膜降解实验表明，无论对E. coli还是S. aureus生物膜，三模态处理的微粒均表现出理想的清除效果。
细胞毒性试验显示，MP1、MP2和MP3处理后的L929细胞活力分别为99.26%、102.75%和97.10%，表明微粒具有优异的细胞相容性。MP3的溶血率仅为0.871%，远低于国际公认的5%安全阈值，显示了良好的血液相容性。此外，斑马鱼共孵育实验亦显示正常的生长发育状态。由于PB和HEC均已获得FDA批准，它们具有良好的生物相容性和生物降解性，是理想的体内应用候选材料。
本研究成功利用绿色气体剪切法制备了仿生HEC@PB MPs，实现了抗生素、光动力和光热三种机制的协同抗菌作用。受褐腐真菌通过ROS降解纤维素的启发，研究者开发了一种新的药物释放控制方法，并成功用PB模拟了GT-螯合剂的功能。这一研究为触发式药物释放和多模态协同策略提供了重要参考，对未来研究具有深远意义。然而，该微粒的光动力作用仅在H₂O₂存在下才能发挥，因此不适合体内应用。尽管如此，该体系在医疗器械和管道抗菌方面具有较好的应用前景。
该研究的主要亮点包括：第一，首次将褐腐真菌的ROS驱动纤维素降解机制引入药物控释领域，实现了仿生触发释放，该设计思路新颖且不依赖复杂的合成方法；第二，所采用的HEC和PB均为FDA批准的成分，大大提高了材料向临床转化的可行性；第三，气体剪切微流控技术实现了一步制备形态均一的核壳结构微粒，粒径单分散性好；第四，三模态协同抗菌策略有效解决了单一抗菌模式易产生耐药性和持久性不足的问题，对生物膜的清除效果显著；第五，通过流变学性质变化而非化学结构变化来证实HEC的降解，为纤维素类材料的降解表征提供了新的视角。