主要作者与发表信息
本研究由温州医科大学口腔医学院、口腔医院、口腔研究所的孙晓宇（Xiaoyu Sun）、吴桐（Tong Wu）、陈淑红（Shuhong Chen）等人完成，通讯作者为孙晓宇、黄盛斌（Shengbin Huang）和梁广（Guang Liang）。该研究成果发表于 Theranostics 期刊，2025年第15卷第14期，页码为6719至6736，DOI为10.7150/thno.111360，于2025年6月9日在线发表。
研究背景与目的
骨稳态（bone homeostasis）依赖于成骨细胞（osteoblast）介导的骨形成与破骨细胞（osteoclast）介导的骨吸收之间的精密平衡。该平衡的破坏会导致多种骨骼疾病，其中以骨质疏松症（osteoporosis）最为常见。去泛素化酶（deubiquitinating enzymes, DUBs）能够从底物蛋白上切割泛素分子，在骨病理生理学中发挥关键调控作用。目前，泛素特异性蛋白酶（ubiquitin-specific proteases, USPs）亚家族中的多个成员如USP26、USP7和USP34已被证明通过不同机制调控骨重塑。然而，卵巢肿瘤蛋白酶（ovarian tumor proteases, OTUs）亚家族中仅OTUB1被证实通过稳定FGFR2促进成骨。卵巢肿瘤去泛素化酶1（OTUD1）作为OTU亚家族成员，既往研究仅涉及其在炎症性疾病如脑缺血和结肠炎症中的作用，其在骨代谢中的功能尚属未知。本研究旨在探究OTUD1在骨重塑中的功能及其分子机制，为破骨细胞依赖性骨病提供新的治疗策略。
研究设计与详细流程
本研究采用了多层次、多方法的实验设计，系统性地揭示了OTUD1在骨代谢中的调控作用。
第一部分：体内动物模型与表型分析。 研究者构建了OTUD1全身性敲除（otud1-/-）雄性小鼠及其同窝对照（otud1+/+）小鼠。通过微型计算机断层扫描（micro-CT）分析股骨远端骨小梁微结构，测量骨密度（bone mineral density, BMD）、骨体积分数（bone volume/tissue volume, BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness, Tb. Th）和骨小梁分离度（trabecular separation, Tb. Sp）等参数。同时进行H&E染色和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP）染色以评估骨组织形态和破骨细胞数量。此外，通过免疫组化检测成骨细胞标志物Runx2的表达，并通过ELISA检测血清中骨吸收标志物I型胶原C端肽（CTX-1）和骨形成标志物I型前胶原氨基端前肽（PINP）的水平。为了进一步明确OTUD1在骨髓来源细胞中的作用，研究者通过骨髓移植构建了髓系细胞特异性OTUD1缺失的嵌合小鼠模型。
第二部分：体外细胞实验与分子机制探索。 研究者从otud1+/+和otud1-/-小鼠股骨和胫骨中分离骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs），在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）诱导下进行破骨细胞分化。通过TRAP染色、RT-qPCR和Western blotting检测破骨细胞分化标志物NFATc1、c-Fos和MMP9的表达。为鉴定OTUD1的底物蛋白，研究者运用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）结合免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）技术，筛选与OTUD1相互作用的蛋白。通过GST pull-down和Co-IP验证OTUD1与底物蛋白的直接结合及结合结构域。采用环己酰亚胺（cycloheximide, CHX）追踪实验检测底物蛋白的半衰期，并通过体内外泛素化实验明确OTUD1对底物蛋白K48连接或K63连接多聚泛素链的切割作用。利用GPS-Uber软件预测底物蛋白的泛素化位点，并通过点突变构建验证关键赖氨酸残基。
第三部分：线粒体功能与氧化应激分析。 使用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）和MitoSOX荧光探针分别检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）和线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species, mtROS）水平。采用DCFH-DA探针检测细胞内总活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，并测定细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）含量。通过透射电子显微镜观察线粒体形态。利用线粒体靶向抗氧化剂MitoQ进行体内外干预实验，验证线粒体功能在OTUD1调控骨代谢中的作用机制。
主要研究发现
OTUD1缺乏导致小鼠骨量丢失。 研究首先发现，在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中，OTUD1的基因和蛋白水平均呈现显著下调趋势。在骨质疏松症患者的股骨组织中，OTUD1的基因表达较健康对照显著降低。免疫荧光分析显示OTUD1与破骨细胞标志物组织蛋白酶K（cathepsin K, CTSK）在健康小鼠股骨中存在共定位。8周龄otud1-/-小鼠的micro-CT分析显示，与otud1+/+同窝对照相比，BMD、BV/TV和Tb. Th显著降低，而Tb. Sp显著增加。TRAP染色显示otud1-/-小鼠股骨中破骨细胞数量和面积显著增加。血清CTX-1水平升高，而PINP水平无显著差异，Runx2阳性成骨细胞数量亦无差异。这些结果表明OTUD1缺失导致的骨量减少主要归因于破骨细胞骨吸收增强，而非成骨功能受损。骨髓移植实验进一步证实，接受otud1-/-骨髓的受体小鼠表现出与全身性敲除相似的骨量减少和破骨细胞活性增强表型，明确了OTUD1在髓系来源的破骨细胞前体中的关键作用。
OTUD1抑制破骨细胞分化。 体外实验中，otud1-/-来源的BMDMs在RANKL诱导后形成的TRAP阳性多核破骨细胞数量显著增多，NFATc1、c-Fos和MMP9的表达上调。相反，OTUD1过表达则抑制破骨细胞分化。值得注意的是，OTUD1缺失并未影响RANKL信号通路中p65和p38的磷酸化水平，提示其调控机制涉及其他信号节点。
PRDX1被鉴定为OTUD1的底物蛋白。 通过LC-MS/MS和Co-IP分析，过氧化物还原酶1（peroxiredoxin 1, PRDX1）被鉴定为OTUD1的结合蛋白。Co-IP实验在HEK-293T细胞和BMDMs中均证实了OTUD1与PRDX1的直接相互作用。结构域分析表明，OTUD1特异性结合PRDX1的N端结构域（氨基酸1-40）。OTUD1过表达升高PRDX1的蛋白水平但不影响其mRNA水平，CHX追踪实验证明OTUD1通过延缓PRDX1降解来稳定其蛋白。在otud1-/-小鼠股骨中，PRDX1蛋白水平显著降低。
OTUD1通过C320位点逆转PRDX1的K48连接泛素化。 泛素化实验表明，OTUD1过表达显著降低PRDX1的总泛素化水平，且特异性切割K48连接多聚泛素链，而不影响K63连接泛素化。OTUD1的催化活性位点C320突变为丝氨酸后，其与PRDX1的结合能力保持不变，但去泛素化活性完全丧失。通过GPS-Uber预测和点突变验证，发现OTUD1主要去除PRDX1第16位赖氨酸（K16）上的泛素分子。PRDX1 K16R突变体转染后，OTUD1对破骨细胞分化的抑制作用被消除，证明K16位点的去泛素化是OTUD1发挥功能的关键。
OTUD1抑制氧化应激相关的线粒体功能障碍。 otud1-/-小鼠股骨中氧化损伤标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-OHdG）水平升高。OTUD1缺失加剧了破骨细胞分化过程中的线粒体功能障碍，表现为ATP水平、总ROS、mtROS和MMP水平的升高。相反，OTUD1过表达则减轻这些线粒体功能异常。MitoQ干预实验显示，在髓系细胞特异性OTUD1缺失小鼠中，MitoQ能够有效缓解骨量丢失和破骨细胞活性增强，降低血清CTX-1水平。进一步研究发现，PRDX1过表达能够挽救OTUD1缺失所导致的破骨细胞分化增强和线粒体功能障碍，证实了OTUD1-PRDX1-线粒体功能轴在调控骨代谢中的核心作用。
研究结论与价值
本研究首次证明了OTUD1通过去泛素化并稳定PRDX1来抑制破骨细胞生成和破骨性骨丢失。在机制上，OTUD1通过其C320催化位点去除PRDX1 K16位点上的K48连接多聚泛素链，阻止PRDX1经蛋白酶体途径降解，从而维持PRDX1的蛋白稳定性。稳定的PRDX1有效清除ROS，减轻氧化应激和线粒体功能障碍，最终抑制破骨细胞分化。该研究不仅揭示了OTU去泛素化酶家族在骨代谢中的新功能，也为骨质疏松症等破骨细胞依赖性骨病的治疗提供了新的潜在靶点。OTUD1作为PRDX1的上游调控因子，为间接增强PRDX1活性提供了理想的干预策略，具有重要的药物开发价值。
研究亮点
本研究的创新性体现在多个方面。首先，这是首个阐明OTUD1在破骨细胞介导的骨丢失中作用的研究，填补了OTU去泛素化酶家族在骨代谢领域的研究空白。其次，研究首次鉴定了PRDX1是OTUD1的底物蛋白，并精确定位了OTUD1的去泛素化位点（C320）和PRDX1的泛素化位点（K16）。此外，本研究采用了从整体动物到细胞分子水平的多层次研究策略，结合LC-MS/MS蛋白质组学、Co-IP、位点突变和线粒体功能分析等多种技术手段，完整地构建了OTUD1-PRDX1-线粒体功能轴的调控网络。研究还通过MitoQ干预实验在体内验证了线粒体功能在该调控轴中的关键地位，为转化医学研究提供了直接的实验依据。