本研究由黄慧、王伟、彭彦昆、吴建虎、高晓东、王秀、张静等作者完成，作者单位为中国农业大学工学院。该研究发表于2010年7月的《光谱学与光谱分析》（Spectroscopy and Spectral Analysis）期刊第30卷第7期。
学术背景
本研究属于农业信息感知与精准农业技术领域，具体聚焦于利用高光谱成像技术进行植物生理生化参数的无损检测。叶绿素含量是反映植物光合作用能力、氮素营养状况、发育阶段以及是否遭受病虫害胁迫的关键生理指标。传统上，测定植物叶片叶绿素含量的标准方法是分光光度法，该方法需要将叶片样本用有机溶剂（如丙酮）研磨萃取，然后利用分光光度计测量提取液在特定波长下的吸光度。这种方法虽然准确，但过程繁琐、耗时费力，且属于破坏性检测，无法实现原位、实时监测。市场上存在如SPAD-502等手持式叶绿素仪，通过测量叶片对特定波长光的透射率来间接估算叶绿素含量，但其测量通常需要接触叶片、多点测量取平均，且无法获取空间分布信息。遥感技术虽然能大范围监测植被叶绿素状况，但分辨率不足以针对单叶片进行精确量化。因此，发展一种能够快速、无损、精确测量单个叶片叶绿素含量的技术，对于实施精准农业中的变量施肥管理、实时诊断作物生长状况具有迫切需求。
在此背景下，高光谱成像技术因其能够同时获取研究对象的空间信息和连续、窄波段的光谱信息而展现出巨大潜力。该技术已成功应用于水果品质分级、蔬菜新鲜度评估、遥感监测植被氮含量、生物量及水分状况等方面。然而，在论文发表时，利用高光谱扫描技术对小麦单叶片叶绿素含量进行定量分析的研究尚未见报道。因此，本研究的核心目标是：结合精准农业项目，探索并建立小麦叶片高光谱反射信息与其叶绿素含量之间的定量关系模型，评估高光谱扫描技术用于小麦叶片叶绿素无损、快速检测的可行性，从而为开发智能化的作物营养诊断与变量施肥装备提供理论基础。
详细工作流程
本研究的工作流程系统而严谨，主要包括样本制备、数据采集、数据处理与建模分析三个主要阶段。
第一阶段：研究材料与样本制备。 试验地点选在北京市昌平区小汤山精准农业示范区，土壤基础养分数据（全氮、有机质、速效氮磷钾）已在文中列出。选用的小麦品种为“京冬-8”。为了获得具有广泛叶绿素含量梯度的样本，研究设置了三个施氮水平：0 kg·hm⁻²（无氮）、120 kg·hm⁻²（适量氮）和270 kg·hm⁻²（过量氮）。施肥按基肥50%、分蘖肥35%、抽穗肥15%的比例进行。样本采集于小麦的三个关键生育期：分蘖期（3月30日）、拔节期（4月18日）和抽穗期（5月1日）。在每个时期，选取长势和大小相近的植株，分蘖期和拔节期取主茎最后一张完全展开叶，抽穗期取植株冠层平整的剑叶。共获取120个叶片样本。采集后，立即进行高光谱图像采集，随后立即用传统分光光度法测定对应叶片的叶绿素含量，确保光谱数据与化学测量值一一对应。
第二阶段：图像采集与叶绿素含量测定。 高光谱图像采集系统由以下几个核心部件构成：高性能CCD相机（Sensicam QE）、高光谱仪（ImSpector V10E，光谱范围400-1100 nm，分辨率2.8 nm）、电控平移台、运动控制器和卤钨灯光源。系统空间分辨率高，点半径小于9微米。数据采集前，进行了标准的黑白板校正：先采集盖上镜头盖的“黑背景”图像用于校正暗电流，再采集标准白板的“白背景”图像用于计算反射率。采集叶片光谱时，将叶片平铺于背景板上，通过高光谱仪扫描获取其反射光谱图像。每个叶片样本约采集500张线图像，这些线图像后续将合成为完整的二维面图像。
在完成光谱图像采集后，立即使用分光光度计法（丙酮萃取法）测定同一叶片（避开叶脉）的叶绿素含量，以此作为建模和验证的基准真值。
第三阶段：数据处理与分析建模。 这是本研究的技术核心，步骤繁多且环环相扣。首先进行数据预处理：利用采集的黑白板图像对原始高光谱图像进行校正，得到反射率图像。然后，将扫描得到的一系列高光谱线图像（BMP格式）通过ENVI软件结合自编的Microsoft VC++ 6.0程序转化为三维数据立方体形式的BSQ格式面图像。图1展示了630 nm波长处的叶片面图像示例。
为了减少噪声和提高模型稳健性，从每个叶片图像中心区域选取多个大小相同的感兴趣区域（ROI），计算每个ROI内所有像素点在每个波长下的平均反射光谱，用该平均光谱代表该叶片的光谱特征。图2显示了高、中、低三种叶绿素含量样本的平均反射光谱曲线，直观表明在450-650 nm（主要是绿光和红光吸收区）以及780-900 nm（近红外平台区）光谱反射率与叶绿素含量呈负相关。
接下来是光谱预处理与特征波段选择。所有光谱分析在MATLAB 7.0软件中进行。首先对原始平均光谱进行5点Savitzky-Golay平滑以去除随机噪声。然后，分别采用三种预处理方法：多元散射校正（MSC）、在一阶导数、二阶导数。MSC旨在消除因叶片表面结构、厚度不均等引起的散射效应。导数处理（尤其是一阶和二阶导数）可以消除基线漂移和背景干扰，放大光谱的细微特征。通过计算叶绿素含量与经过不同预处理后的光谱在各波长下的相关系数（图3），研究者发现550-800 nm波段相关系数较高。考虑到仪器在波段两端信噪比较低，最终选定491-887 nm范围作为建模波段。
建模采用了两种经典的化学计量学方法：偏最小二乘回归（PLSR）和逐步多元线性回归（SMLR）。对于PLSR，采用交叉验证法确定最佳主成分数（潜变量数）。图4展示了不同预处理光谱对应的交叉验证误差随主成分数变化的曲线，据此确定了MSC、一阶导数、二阶导数光谱的最佳主成分数分别为4、3和10个。然后利用这些主成分建立PLSR校正模型。
对于SMLR，其核心是从491-887 nm的众多波长中自动筛选出与叶绿素含量最相关的几个特征波长，建立简约的线性回归模型。表2列出了三种预处理方法下SMLR筛选出的特征波长及模型决定系数。例如，经MSC+二阶导数处理后，筛选出的特征波长为530, 582, 660, 704 nm，模型决定系数达0.86。基于这些特征波长，建立了具体的线性回归方程（如文中的公式3）。
最后，将120个总样本划分为校正集（90个样本）和独立的预测集（30个样本）。表3显示了两组样本叶绿素含量的统计信息（最大值、最小值、均值、标准差），表明样本分布合理，覆盖了足够的浓度范围，保证了模型的代表性和普适性。分别使用PLSR和SMLR建立的模型对预测集样本进行预测，并通过校正集决定系数（R²c）、预测集决定系数（R²v）、校正均方根误差（RMSEC）和预测均方根误差（RMSEP）等指标来综合评价模型的校准能力和预测精度。
主要研究结果
研究获得了详实的建模与预测结果，并对不同方法进行了比较。
样本集统计结果： 如表3所示，总样本、校正集和预测集的叶绿素含量范围、均值及标准差均较为接近，说明样本划分合理，校正集能够充分代表预测集的变异范围，为建立可靠模型奠定了基础。
PLSR建模结果： 表4总结了不同预处理方法下PLSR模型的性能。总体来看，PLSR模型取得了不错的效果。其中，仅使用MSC预处理的模型表现相对均衡，其校正集R²c为0.80，RMSEC为0.68；预测集R²v为0.63，RMSEP为0.70。而经过MSC+二阶导数预处理后，虽然校正集R²c高达0.95，但预测集R²v降至0.60，且RMSEP（0.78）与RMSEC（0.71）差值较大，表明模型可能存在过拟合现象，即对校正数据拟合过度，导致对新样本的预测能力下降。
SMLR建模结果： 表5展示了SMLR模型的性能。与PLSR相比，SMLR模型整体表现更优，尤其是预测能力更为稳定。三种预处理方法中，MSC+一阶导数和MSC+二阶导数模型均取得了较好的预测结果。其中，MSC结合二阶导数处理的SMLR模型效果最佳。该模型采用了530, 582, 660, 704 nm四个特征波长，其校正集决定系数R²c为0.82，校正均方根误差RMSEC为0.69；预测集决定系数R²v为0.79，预测均方根误差RMSEP为0.71。RMSEC与RMSEP数值接近且均较低，表明模型具有较高的校准精度和良好的预测稳定性，未出现明显过拟合。
图5和图6分别展示了该最优模型的校正和验证散点图，直观地反映了叶绿素含量实测值与模型预测值之间良好的线性关系。
结果分析与逻辑衔接： 研究首先通过光谱与叶绿素含量的相关性分析（图2，图3），确定了敏感波段（491-887 nm），这为后续建模限定了有效的数据范围，避免了噪声波段干扰。然后，通过比较PLSR和SMLR两种建模策略，发现基于特征波长筛选的SMLR方法在本研究中优于全波段建模的PLSR方法。这很可能是因为SMLR通过筛选，剔除了大量冗余或共线性的光谱变量，只保留了与叶绿素生理生化特性直接相关的关键波长（如530 nm附近的绿光反射峰、582 nm和660 nm附近的红光吸收谷、704 nm附近的“红边”区域），从而构建了更简洁、更稳健的模型。此外，对预处理方法的比较表明，MSC有效消除了叶片物理结构差异带来的散射影响，而二阶导数处理进一步消除了基线漂移，增强了光谱的细节特征，两者结合显著提升了模型性能。这些结果层层递进，从数据预处理、特征提取到模型选择与优化，最终指向了一个稳定可靠的定量分析模型。
结论
本研究得出明确结论：应用高光谱扫描技术无损检测小麦叶片叶绿素含量是可行的。 通过系统比较，研究发现基于多元散射校正（MSC）结合二阶导数光谱预处理，并采用逐步多元线性回归（SMLR）方法在特征波长（530, 582, 660, 704 nm）上建立的模型为最优模型。该模型校正集和预测集的决定系数分别达到0.82和0.79，校正与预测误差均较低且接近，表明模型具有较高的精度和良好的预测能力。
研究的价值与意义
本研究具有重要的科学价值与应用前景。在科学价值上，它首次系统报道了将高光谱成像技术应用于小麦单叶片叶绿素含量的定量无损检测，丰富了高光谱技术在农业微观生理参数检测领域的应用案例，为理解叶片光谱特征与内部色素含量的关系提供了具体的数据支持和模型方法。在应用价值上，该方法克服了传统化学方法的破坏性、耗时缺点，也弥补了手持式叶绿素仪信息单一、需接触测量的不足，为实现作物生长状态的快速、原位、可视化诊断提供了强有力的技术手段。这项研究为后续开发集成于农业机械（如变量施肥机）的在线实时监测传感器奠定了坚实的理论基础和算法基础，是推动精准农业从理论走向实践的关键一步。
研究亮点
其他有价值的内容
论文在讨论部分也坦诚指出了本研究的局限性并展望了未来方向。例如，样本采自大田，会受到叶片表面灰尘、新鲜度保持等因素的影响。尽管通过MSC和导数处理在一定程度上消除了这些影响，但未来仍需通过增加建模样本数量、涵盖更多小麦品种、尝试透射等其他光学检测方式，来构建更具鲁棒性和广泛适应性的通用模型，进一步提高预测精度。这些思考为后续研究指明了方向。