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粘质沙雷氏菌复合体的全球种群结构及医院适应谱系的鉴定
主要作者与研究机构 本研究发表于期刊 Microbial Genomics (2022;8:000793)，主要通讯作者为日本九州大学医学研究生院细菌学系的林哲也 (Tetsuya Hayashi)。第一作者为九州大学的小野智之 (Tomoyuki Ono) 和谷口树 (Itsuki Taniguchi)。研究团队来自日本多家机构，包括九州大学、久留米大学、宫崎大学、京都大学、东京工业大学及京都药科大学，并与法国图卢兹大学的Eric Oswald团队合作完成。
研究背景与目的 粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) 是一种重要的革兰氏阴性机会性病原体，可导致尿路感染、菌血症等多种院内感染，甚至引发医院暴发。近年来，多重耐药 (multidrug-resistant, MDR) 菌株的出现和传播对全球公共卫生构成了严重威胁。该细菌同样广泛存在于自然环境中，但临床与环境分离株之间的基因组差异，包括粘质沙雷氏菌与其近缘种间的差异，此前尚不清晰。此外，沙雷氏菌属的分类，尤其是粘质沙雷氏菌及其近缘种（如嗜线虫沙雷氏菌 *S. nematodiphila*、解脲沙雷氏菌 S. ureilytica 及表面活性剂沙雷氏菌 *S. surfactantfaciens*）的种间关系，也尚未得到充分阐明。为了解决这些问题，本研究开展了一项大规模的基因组分析，旨在揭示被称为“粘质沙雷氏菌复合体 (S. marcescens complex)”的种群结构和系统发育关系，并探索其基因组差异和临床相关谱系的特征。
详细研究工作流程 本研究的工作流程主要包含以下几个步骤： 1. 菌株收集、测序与公共数据整合：研究首先从日本和法国多个地区采集了土壤样本，并使用脱氧核糖核酸酶-甲苯胺蓝-头孢菌素 (deoxyribonuclease-toluidine blue-cephalothin, DTC) 琼脂平板进行选择性分离。通过16S rRNA基因测序（与参考菌株Sm39的序列一致性>99%）进行物种鉴定后，共计获得了108株土壤环境分离株。同时，从日本和法国多家医院收集了117株临床分离株。这225株菌均使用Illumina MiSeq平台进行全基因组测序 (whole-genome sequencing, WGS) 并从头组装。此外，研究团队从美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 数据库下载了644个已注册为粘质沙雷氏菌复合体成员的基因组数据。经过严格的质量过滤（使用CheckM软件，完整性<99%或污染度>3%的基因组被剔除）和去冗余后，最终保留了775个高质量基因组用于后续分析，这极大地扩展了环境菌株的基因组资源。 2. 物种系统发育分析与复合体定义：为了明确粘质沙雷氏菌与其近缘种的关系，研究首先对沙雷氏菌属17个种/亚种的模式菌株及两个已完成测序的菌株 (Db11和Sm39) 进行了核心基因系统发育分析和平均核苷酸一致性 (Average Nucleotide Identity, ANI) 分析。结果显示，粘质沙雷氏菌、嗜线虫沙雷氏菌、解脲沙雷氏菌和表面活性剂沙雷氏菌的模式菌株形成一个紧密的聚类。据此，研究将这些物种初步定义为“粘质沙雷氏菌复合体”，作为核心研究对象。 3. 基于ANI的聚类与分支定义：对纳入的775株菌进行全基因组范围内的两两ANI分析，并采用完全连锁聚类法构建树状图。研究以97%的ANI作为阈值进行分支 (clade) 划分，最终将775株菌划分为14个分支。 4. 核心基因系统发育与泛基因组聚类分析：通过Roary软件鉴定了在99%菌株中存在的核心基因（共2,488个），基于核心基因比对中的182,520个单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms, SNPs) 位点，利用RAxML构建了最大似然法 (Maximum-Likelihood, ML) 系统发育树。同时，基于34,342个泛基因存在/缺失矩阵，采用Ward聚类法对所有菌株进行了泛基因组聚类分析，以评估附属基因的分布模式。 5. 基因组特征、移动遗传元件和分离源分析：为减少菌株偏差，研究以SNP距离≤10为标准定义了619个SNP10聚类，并从每个多重聚类中随机选取一株作为代表菌株，用于后续统计分析。通过比较各分支代表菌株的基因组大小、GC含量、质粒复制子及整合酶基因（作为前噬菌体和其他整合性元件的标记）数量，分析其基因组变异与水平基因转移的关联。最后，通过费舍尔精确检验分析各分支中临床/医院环境分离株的比例差异。 6. 耐药基因与耐药性分析：使用SRST2软件和ARG-ANNOT数据库鉴定抗菌药物耐药 (antimicrobial resistance, AMR) 基因，并通过ART软件模拟短读序对未测序菌株进行分析。对于氟喹诺酮耐药性 (fluoroquinolone resistance, FQR) 决定区 (quinolone-resistance-determining region, QRDR) 的突变，则通过比对氨基酸序列进行鉴定。最后，根据已鉴定AMR基因和FQR突变，按照Magiorakos等人的定义筛选MDR菌株。 7. 毒力相关基因与分支特异性基因鉴定：研究分析了已知潜在毒力相关基因/操纵子的分布，并利用Scoary软件筛选在分支1和2中特异性保守（存在率>90%）的附属基因。
主要研究结果 1. 复合体的种群结构与分类：研究成功将粘质沙雷氏菌复合体划分为14个分支。系统发育树、ANI聚类及泛基因组聚类结果高度一致，验证了这14个分支划分的可靠性。其中，分支10、11、12和13分别对应嗜线虫沙雷氏菌、粘质沙雷氏菌严格意义上的种 (sensu stricto)、解脲沙雷氏菌和表面活性剂沙雷氏菌的模式菌株。值得注意的是，粘质沙雷氏菌的樱花亚种模式菌株也落入分支11，证实了其不应被独立划分为亚种的观点，揭示了该复合体内复杂的种系关系及传统16S rRNA鉴定分辨率的不足。 2. 基因组特征与进化动态：各分支间的基因组大小和GC含量存在显著差异。其中，分支2的基因组显著大于其他分支，GC含量显著偏低。进一步分析发现，所有含10个以上代表菌株的分支内，基因组大小与GC含量均呈负相关。这一现象与移动遗传元件的获得有关。具体而言，分支2更大更低的基因组主要是因为积累了更多的质粒和前噬菌体。有趣的是，不同分支内驱动基因组变异的主要移动元件类型似乎不同，例如在分支1、3、4等中，基因组大小与整合酶基因数量呈正相关，而在分支2、6、12中，基因组大小与质粒复制子数量呈正相关。这表明不同谱系适应环境的进化模式可能存在差异。 3. 医院适应谱系的鉴定：这是本研究的核心医学发现。通过对619个代表菌株的分离源分析，研究发现分支1和2几乎完全由临床或医院环境分离株组成（比例分别为99.2%和98.8%），显著高于整体菌株集的平均水平（73.8%）。与此形成鲜明对比的是，分支6、10、11、12和13中临床/医院环境菌株的比例显著偏低。这有力地证明了分支1和2代表了该复合体中的医院适应谱系。 4. 耐药基因与突变的显著积累：在医院适应谱系中，AMR基因和FQR突变发生了显著积累。分支1和2的菌株大量携带通过水平基因转移获得的额外耐药基因。在分支2中，几乎全部代表菌株（97.6%）被基因型定义为MDR。在超广谱β-内酰胺酶 (Extended-Spectrum β-Lactamase, ESBL) 和碳青霉烯酶基因分布上，两个谱系呈现出不同的积累模式。分支1的ESBL基因以 *bla*TEM-1D 和 *bla*CTX-M1 为主，而分支2则以 *bla*TEM-1D 和 *bla*SHV-OKP-LEN 为主，且两者常同时存在。分支2的碳青霉烯酶基因积累更为突出，81.9%的代表菌株携带碳青霉烯酶基因，其中绝大多数为 *bla*KPC-1。此外，分支1和2中分别有67.4%和85.5%的代表菌株携带gyrA基因的FQR突变，部分菌株还额外携带parC和parE突变。这些结果暗示，长期在临床环境中面临抗生素选择压力是导致这些谱系耐药性积累的主要原因。
研究结论与价值 本研究通过对粘质沙雷氏菌复合体进行大规模基因组分析，首次明确揭示了该复合体由14个分化明显的分支构成的全球种群结构，为未来该菌群的重新分类提供了至关重要的基因组学基础。研究最重要的价值在于鉴定出两个独立的医院适应谱系（分支1和分支2），它们已进化成医院环境中AMR基因的重要储库。尽管这两个谱系的毒力潜力尚不清楚，但因其携带包括多种碳青霉烯酶和ESBL基因在内的广泛耐药基因，在临床治疗中必须给予特别关注。
研究亮点 1. 大规模环境菌株测序：本研究新增了108株土壤环境分离株的基因组，极大地弥补了公开数据库中环境菌株样本的不足，为准确解析临床与环境菌株的基因组差异提供了关键数据。 2. 清晰的种群框架：通过ANI、核心基因组系统发育和泛基因组分析三者相互印证，提出了一个包含14个分支的清晰、稳定的种群结构，澄清了该复合体内部的复杂分类关系。 3. 发现医院适应谱系：不仅证实了临床菌株富集谱系的存在，更通过详细的基因组特征和耐药性分析，揭示了它们通过积累不同类型移动遗传元件（质粒或噬菌体）而具备强大耐药潜力的进化机制，为医院感染监测和防控提供了明确的靶标。