本研究由上海交通大学医学院附属同仁医院肾内科的王晓霞教授和电子科技大学医学院附属成都妇女儿童中心医院的张玲教授共同担任通讯作者，第一作者为王燕哲、刘玉圆和陈思嘉。该研究成果于2023年8月23日发表于《Frontiers in Pharmacology》期刊，论文标题为《基于网络药理学与实验验证揭示脱水丹参酮在糖尿病肾病中的保护机制》。研究团队来自上海交通大学、南京医科大学、浙江大学、复旦大学及电子科技大学等多家学术和医疗机构。

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常见的慢性微血管并发症，也是终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）的主要病因之一。DKD的发病机制复杂，涉及代谢紊乱、血流动力学改变、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡及自噬等多个方面。现有治疗手段包括DPP-4抑制剂、SGLT-2抑制剂、ROCK抑制剂、ACEI及ARB等药物，虽然能在一定程度上延缓疾病进展，但无法完全阻止或逆转DKD的进程。DKD早期最核心的病理改变是肾小球系膜细胞（human mesangial cells，HMCs）的表型转换（phenotypic switching），表现为系膜细胞肥大和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积增加，进而导致肾小球肥大、基底膜增厚以及弥漫性肾小球硬化。因此，寻找能够延缓HMCs表型转换的药物具有重要的临床意义。丹参（Salvia miltiorrhiza，SM）是中医治疗DKD的常用药物之一，在中国DKD临床处方中使用频率排名第二。然而，丹参改善HMCs表型转换的具体分子机制尚未阐明。本研究旨在通过网络药理学方法联合转录组学数据筛选丹参治疗DKD的关键活性成分和作用靶点，并通过体外和体内实验验证其具体机制。

研究首先对来自DKD患者和对照组的肾组织样本进行了转录组学分析。DKD组选取Mogensen分期为3期的2型糖尿病肾病患者，对照组为因肾肿瘤行肾切除的非糖尿病患者的正常肾组织。通过Affymetrix人Clariom D基因芯片检测，共筛选出4864个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中297个基因上调，4567个基因下调。与此同时，利用TCMSP数据库对丹参的活性成分进行ADME筛选，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥20%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件，得到89个丹参活性成分。进一步通过BATMAN和Swiss Target Prediction数据库预测药物靶点，共获得675个潜在药物作用基因。DKD疾病相关靶点来源于GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD、DisGeNET和DrugBank六个数据库，去重后得到11677个疾病靶点。将上述三部分数据取交集，共获得161个共同靶点。

对这161个共同靶点进行GO和KEGG功能富集分析，结果表明这些靶点显著富集于细胞凋亡、PI3K-Akt信号通路以及糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等生物学过程。为筛选核心靶基因，研究构建了蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，该网络包含157个节点和1634条边。利用MCODE聚类分析识别出三个核心网络模块，其中得分最高的模块种子基因为PIK3CA。根据网络拓扑参数筛选出丹参中排名前三的活性成分——脱水丹参酮（dehydromiltirone，DHT）、香紫苏醇（sclareol）和aethiopinone，并通过分子对接技术评估其与核心靶点的结合能力。对接结果显示，DHT与PIK3CA的结合能最低（−8.6 kJ/mol），结合方式最为稳定，因此被确定为进一步研究的关键活性成分。分子动力学模拟（molecular dynamics simulation，MDS）和MM/GBSA结合自由能计算进一步证实了DHT与PIK3CA之间具有较强的结合亲和力，结合自由能为−28.64 ± 0.89 kcal/mol，其中范德华力和非极性溶剂化自由能是主要贡献因素。

在体外实验部分，研究首先通过CCK-8法确定DHT的安全浓度范围，发现5 μM以内的DHT对HMCs细胞活力无显著影响。免疫荧光结果显示，高糖诱导的HMCs中α-SMA绿色荧光信号明显增强，而不同浓度DHT干预后荧光信号显著减弱。Western blot分析表明，高糖刺激48小时后，HMCs中PIK3CA、p-PI3K/ PI3K、p-Akt/Akt以及表型转换标志蛋白α-SMA、I型胶原（collagen I，Col-I）和纤连蛋白（fibronectin，FN）的表达均显著上调；而5 μM DHT干预后，上述蛋白表达明显下降。为验证PIK3CA在DHT介导的PI3K-Akt信号通路调控中的作用，研究者使用siRNA沉默PIK3CA表达。结果显示，敲低PIK3CA后，HMCs中PIK3CA、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt以及α-SMA、Col-I和FN的表达均被显著抑制，且在此基础上DHT干预对上述蛋白表达无进一步显著影响。这表明DHT通过抑制PIK3CA调控的PI3K-Akt信号通路来抑制高糖诱导的HMCs表型转换。

在体内实验部分，研究者使用BKS-db/db自发性2型糖尿病小鼠建立DKD模型，小鼠8周龄起腹腔注射不同剂量DHT（10 mg/kg和20 mg/kg），每3天给药一次，持续16周。结果显示，DHT干预能够显著降低DKD小鼠的体重、血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和24小时尿白蛋白排泄量，且高剂量组效果更为显著，但DHT干预对空腹血糖水平无显著影响。肾脏组织病理学分析显示，与正常对照组相比，DKD组小鼠肾小球明显肥大、系膜基质增生和胶原沉积增加。H&E染色显示DHT治疗组肾小球面积明显缩小；PAS染色显示DHT干预可显著减轻系膜扩张和基质增生；Masson染色和PASM染色表明DHT治疗组肾小球纤维化和胶原沉积显著改善；免疫组化结果显示DHT治疗组α-SMA表达显著低于DKD组。Western blot结果证实，DHT在体内同样能抑制PIK3CA、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt以及α-SMA、Col-I和FN的表达。

本研究的主要结论为：DHT是丹参治疗DKD的关键活性成分，其治疗机制是通过与PIK3CA蛋白结合进而抑制PI3K-Akt信号通路的过度激活，从而抑制肾小球系膜细胞的表型转换，减少ECM沉积，改善肾小球肥大，最终发挥肾脏保护作用。该研究的意义在于提出DHT可能作为一种新型的PIK3CA抑制剂用于DKD的治疗，为DKD的防治提供了新的策略和候选药物。同时，该研究展示了转录组学与网络药理学相结合的方法在中药活性成分和作用靶点筛选方面的应用价值。

本研究的亮点在于：将临床样本转录组学数据与网络药理学技术相结合，克服了传统网络药理学仅依赖数据库靶点预测的局限性；利用分子对接和分子动力学模拟等多种计算手段系统验证了DHT与PIK3CA的结合模式；通过体外和体内多层面实验验证了DHT通过PIK3CA信号通路抑制系膜细胞表型转换的作用机制。研究的局限性主要包括：活性成分筛选阈值存在主观性，可能遗漏其他有效成分；单一芯片分析可能带来假阳性结果；DHT的临床应用安全性尚需进一步评估。