关于糖皮质激素通过CXCR4/PLC信号轴在B细胞急性淋巴细胞白血病中矛盾性促进其自身耐药性的研究报告
本研究由法国鲁昂诺曼底大学的Souleymane Abdoul-Azize博士领衔，联合来自法国国家健康与医学研究院（INSERM）、法国布雷斯特大学、美国威尔康奈尔医学中心等机构的研究人员共同完成。研究成果以题为“Glucocorticoids paradoxically promote steroid resistance in B cell acute lymphoblastic leukemia through CXCR4/PLC signaling”的论文形式，于2024年发表在《自然-通讯》（*Nature Communications*）期刊上。
一、 学术背景与研究目的
本研究属于肿瘤学与血液病学交叉领域，聚焦于儿童B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）治疗中面临的严峻挑战——糖皮质激素（Glucocorticoid, GC）耐药性。B-ALL是最常见的儿童癌症，尽管过去几十年整体治愈率显著提升，但仍有约20-25%的患者最终复发，其中GC耐药是导致治疗失败和复发的主要驱动因素。在临床实践中，GC（如地塞米松Dexamethasone, Dex）是诱导化疗的核心药物，其早期治疗反应是评估预后的关键指标。然而，部分患者从一开始就表现出对GC的原发性耐药，其背后的分子机制尚不完全清楚。
传统观点认为，GC通过与胞质内糖皮质激素受体（GR）结合，转位入核调控一系列促凋亡基因的表达，从而杀死白血病细胞。但近年有证据表明，GC也可能通过非基因组效应意外地诱导或促进其自身耐药。例如，先前研究提示在B-ALL中，GC能刺激细胞内钙离子（Ca²⁺）信号，触发促生存程序，而螯合Ca²⁺则可提高GC敏感性。因此，阐明GC诱导的Ca²⁺信号通路如何导致耐药，对于开发逆转耐药、改善患者预后的新策略至关重要。
本研究旨在探究GC原发性耐药的机制。研究人员假设GC可能通过激活特定的细胞表面受体信号，异常活化下游促生存通路，从而对抗其自身的促凋亡效应。研究重点关注与B细胞Ca²⁺信号密切相关的磷脂酶Cγ2（PLCγ2）及其上游可能的调控受体——趋化因子受体CXCR4。研究目标包括：1. 验证PLCγ2在B-ALL中的表达与激活状态；2. 探究GC是否通过激活CXCR4/PLCγ2轴引发Ca²⁺信号及下游促生存反应；3. 评估靶向CXCR4或PLC能否在体内外逆转B-ALL细胞对GC的耐药性。
二、 详细研究流程
本研究采用多层次的实验体系，整合了生物信息学分析、体外细胞实验、体外患者原代细胞实验以及体内小鼠模型验证。
流程一：B-ALL中PLCγ2表达与活性的基础分析 * 研究对象与样本量：首先利用公共数据库进行分析，包括包含1933例白血病患者的“白血病微阵列创新”（MILE）研究数据集、包含多种癌细胞系的癌症细胞系百科全书（CCLE）数据库、Oncomine数据库、GEPIA数据库等。体外实验使用12种B-ALL细胞系（如NALM-6、RS4;11、REH等）以及正常B细胞作为对照。 * 研究方法： 1. 生物信息学分析：通过KEGG通路富集分析，发现Ca²⁺信号通路在B-ALL患者样本中显著上调。在PLC家族成员中，PLCγ2的mRNA水平在B-ALL细胞系中表达最高，且在多种癌症中，PLCγ2在B-ALL中的表达排名前列。分析还显示，与正常样本相比，B-ALL患者样本中PLCγ2及其下游靶基因（如ITPR3, PRKCβ）的mRNA水平升高。 2. 蛋白质水平验证：使用流式细胞术检测B-ALL细胞系（NALM-6, RS4;11）和正常B细胞中PLCγ2的总蛋白水平及其酪氨酸759位点（Tyr759）的磷酸化（活性）水平。 3. 功能性检测：使用Fura-2染料，在无细胞外Ca²⁺的条件下，通过显微成像法测量B-ALL细胞在内质网（ER）Ca²⁺释放剂（如Carbachol或ATP）刺激下的Ca²⁺动员。同时，在PLC抑制剂（如U73122, Edelfosine, Manoalide等）存在下进行相同实验，以验证PLC活性对ER Ca²⁺释放的贡献。
流程二：PLC抑制对B-ALL细胞存活、耐药及转录组的影响 * 研究对象：B-ALL细胞系（NALM-6, RS4;11, REH）以及通过长期体外暴露于递增浓度Dex构建的Dex耐药细胞系（NALM-6 R）。同时，使用来自44名ALL患者的原代外周血和骨髓样本（其中根据体外对100 nM Dex的反应，定义了对Dex敏感和耐药的样本）。 * 研究方法： 1. 细胞活力与凋亡检测：使用CCK-8试剂或Live/Dead®染色试剂盒检测细胞活力。使用膜联蛋白V（Annexin V）/碘化丙啶（PI）染色和Caspase-3活性测定评估细胞凋亡。使用多种PLC抑制剂（U73122等）、PKC抑制剂（如GF109203X）、IP3受体抑制剂（2-APB）以及钙调磷酸酶抑制剂（环孢素A、他克莫司）进行处理。 2. 耐药模型构建与表征：将NALM-6细胞在递增浓度的Dex中培养44天，随后在无药培养基中恢复14天，获得稳定耐药株。通过剂量反应曲线验证其耐药性。比较敏感与耐药细胞中GR的表达以及PLCγ2的基础磷酸化水平。 3. 转录组学分析：对Dex耐药的NALM-6 R细胞进行RNA测序（RNA-seq），比较经PLC抑制剂U73122处理与对照组（CTR）的基因表达差异。使用DESeq2进行差异表达基因（DEG）分析，并通过基因集富集分析（GSEA）、Reactome、KEGG和基因本体论（GO）分析研究受影响的信号通路。 4. 细胞周期分析：使用碘化丙啶（PI）染色结合流式细胞术分析细胞周期分布。
流程三：Dex如何激活PLC/Ca²⁺信号通路 * 研究对象：多种B-ALL细胞系。 * 研究方法： 1. Ca²⁺信号检测：使用Fura-2或Fluo-4 AM染料，通过单细胞显微成像或荧光检测板，实时测量Dex刺激引起的胞质Ca²⁺变化。分别在含Ca²⁺和无Ca²⁺缓冲液中进行，以区分ER Ca²⁺释放和钙池操纵性钙内流（SOCE）。 2. PLC活性检测：使用荧光底物法直接测定Dex刺激后细胞PLC的酶活性。 3. 信号分子激活检测：在Dex刺激后，通过流式细胞术（Phospho-flow）检测PLCγ2在Tyr759位点的磷酸化水平。使用ELISA法检测PKC的活性。 4. 基因沉默与基因编辑：使用小干扰RNA（siRNA）敲低PLCγ2或CXCR4的表达。使用CRISPR/Cas9技术敲除B-ALL细胞中的CXCR4基因，并通过流式细胞术和功能实验验证敲除效率。
流程四：CXCR4在Dex诱导的PLC激活中的作用 * 研究对象：B-ALL细胞系及CRISPR编辑的细胞。 * 研究方法： 1. 关联分析：利用R2数据库对MILE数据集进行全基因组共表达网络分析，寻找与PLCγ2表达高度正相关且参与Ca²⁺信号传导的基因。 2. CXCR4表达与功能分析：通过数据库分析和流式细胞术验证CXCR4在B-ALL中的高表达。使用CXCR4天然配体SDF-1α刺激细胞，检测Ca²⁺信号，并用CXCR4拮抗剂（AMD3100, AMD3465, WZ811, MSK122）阻断以验证其功能。 3. 机制探究：将CXCR4拮抗剂、siRNA或CRISPR-CXCR4细胞与Dex刺激结合，检测对Dex诱导的Ca²⁺信号、PLCγ2磷酸化、ER Ca²⁺释放和SOCE的影响。研究Dex刺激后CXCR4受体的内化现象（通过流式细胞术检测表面表达变化），并探索其是否依赖GR（使用GR拮抗剂RU486）或受脂筏影响（使用甲基-β-环糊精M-βCD破坏脂筏）。
流程五：靶向CXCR4/PLC轴在体内外逆转Dex耐药的效果 * 研究对象： * 体外：B-ALL细胞系、Dex耐药细胞系、患者原代耐药细胞。 * 体内：免疫缺陷的NOD scid gamma (NSG)小鼠模型。小鼠通过尾静脉注射表达荧光素酶和GFP的NALM-6细胞（敏感或耐药株）或天然耐药的RCH-ACV细胞建立白血病模型。 * 研究方法： 1. 体外联合治疗：将Dex与CXCR4拮抗剂、PLC抑制剂、PKC抑制剂等联合处理细胞，评估细胞活力、凋亡和细胞周期变化。 2. 体内疗效评估：在白血病小鼠模型中，将小鼠随机分组，分别给予溶剂对照、Dex单药、CXCR4拮抗剂（AMD3465）单药、PLC抑制剂（U73122）单药、Dex与拮抗剂/抑制剂联合治疗。通过生物发光成像（BLI）和流式细胞术检测白血病负荷，记录小鼠的总生存期（OS）。在治疗期间，还从小鼠外周血分离白血病细胞，检测其Ca²⁺信号对Dex的反应。
三、 主要研究结果
结果一：PLCγ2在B-ALL细胞中高表达且组成性激活。 生物信息学分析显示Ca²⁺信号通路和PLCγ2在B-ALL中显著富集和高表达。实验证实B-ALL细胞系中PLCγ2的蛋白水平和基础磷酸化水平均高于正常B细胞。在无外钙条件下，PLC抑制剂能显著抑制由激动剂诱发的ER Ca²⁺释放，证明PLCγ2在B-ALL中具有功能活性。
结果二：抑制PLC通路可诱导B-ALL细胞死亡，并克服Dex耐药。 PLC抑制剂、PKC抑制剂、IP3R抑制剂和钙调磷酸酶抑制剂均能有效降低多种B-ALL细胞系的活力并诱导凋亡。在构建的Dex耐药NALM-6 R细胞中，PLC抑制剂和PKC抑制剂同样能诱导细胞死亡。RNA-seq分析显示，PLC抑制剂U73122处理Dex耐药细胞后，显著下调了与细胞周期（如DNA复制、姐妹染色单体分离）相关的基因通路，同时上调了内质网应激诱导的凋亡相关基因。细胞周期分析证实PLC抑制剂导致细胞阻滞在SubG1期（凋亡峰）。在44例患者原代样本中，PLC抑制剂U73122能使62%的Dex耐药外周血样本和52%的耐药骨髓样本恢复对Dex的敏感性。
结果三：Dex通过激活PLCγ2触发Ca²⁺信号。 Dex刺激能引起B-ALL细胞快速、持续的胞质Ca²⁺升高，该信号包括ER Ca²⁺释放和随后的SOCE。Dex刺激后5分钟即可检测到PLCγ2磷酸化水平显著升高，24小时处理可增加PLC酶活性。所有PLC抑制剂均能有效阻断Dex诱导的Ca²⁺信号。敲低PLCγ2也能产生类似效果。
结果四：CXCR4介导了Dex诱导的PLCγ2/Ca²⁺轴激活。 共表达网络分析筛选出与PLCγ2高度正相关且参与Ca²⁺信号的基因，其中CXCR4在B-ALL细胞系中表达最高。CXCR4拮抗剂、siRNA敲低或CRISPR敲除CXCR4，均能显著抑制Dex诱导的Ca²⁺信号、PLCγ2磷酸化、ER Ca²⁺释放和SOCE。Dex刺激能迅速引起CXCR4受体从细胞表面内化（5分钟内），这一过程不依赖于经典的GR基因组通路（RU486无法阻断Ca²⁺信号），且Dex与SDF-1α在激活Ca²⁺信号上存在竞争关系。破坏脂筏会减弱Dex诱导的Ca²⁺信号。
结果五：抑制CXCR4/PLC轴在体内外增强Dex敏感性并改善生存。 CXCR4拮抗剂与Dex联用，在体外能协同诱导B-ALL细胞凋亡和细胞周期阻滞，并恢复部分患者原代耐药细胞对Dex的敏感性。在NSG小鼠白血病模型中，Dex单药治疗能延长小鼠生存期，而联合CXCR4拮抗剂AMD3465或PLC抑制剂U73122能进一步显著提高生存获益。这一效果在Dex敏感和Dex耐药的细胞系构建的模型中都得到了验证。从联合治疗组小鼠体内分离的白血病细胞，其对Dex刺激的Ca²⁺反应也明显减弱。
四、 研究结论与价值
本研究揭示了儿童B-ALL中GC原发性耐药的一个关键矛盾性机制：作为治疗药物的糖皮质激素（Dex），其本身会通过快速、非基因组的途径激活白血病细胞表面的CXCR4受体，进而触发下游PLCγ2信号体的异常活化。PLCγ2的激活导致IP3和DAG产生，分别引起ER Ca²⁺释放/PKC激活以及钙调磷酸酶/NFAT通路活化，这些促生存信号最终拮抗了GC通过GR介导的经典促凋亡程序，从而导致或加剧了GC耐药。
科学价值：本研究首次系统阐明了CXCR4/PLCγ2信号轴在介导B-ALL对GC原发性耐药中的核心作用，将GC的非基因组效应（Ca²⁺信号）与具体的受体（CXCR4）和效应分子（PLCγ2）通路联系起来，为理解GC耐药这一长期临床难题提供了全新的分子视角。
应用价值：研究提出了潜在的治疗新策略。靶向CXCR4（使用其拮抗剂）或直接抑制PLC，可以作为化疗增敏剂，与现有GC方案联合使用，以克服或预防原发性及获得性GC耐药，有望改善高危B-ALL患者的预后。本研究在体外患者样本和体内小鼠模型中均验证了这一策略的有效性，为后续的临床转化研究奠定了坚实的临床前基础。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究还发现，除了PKC和钙调磷酸酶，与PLC/Ca²⁺信号相互关联的mTOR和AKT通路也可能参与GC耐药，抑制这些通路同样能部分逆转耐药，提示了该促生存网络的复杂性。此外，研究指出PLCγ2的过度活化可能与早期复发（≤34个月）相关，这为利用该通路作为预后生物标志物提供了线索。最后，作者讨论了GC可能直接或间接与CXCR4相互作用，以及该机制在肿瘤微环境（如基质细胞保护）中可能同样起作用，为未来更深入的研究指明了方向。