非小细胞肺癌奥希替尼耐药新机制：circ_PPAPDC1A通过吸附miR-30a-3p激活IGF1R通路

研究团队与发表信息 本研究由Tang, Yi‑Fang（第一作者）、Liu, Zheng‑Hua、Zhang, Lei‑Yi、Shi, Sheng‑Hao、Xu, Shun、Ma, Jin‑An、Hu, Chun‑Hong以及通讯作者Zou, Fang‑Wen共同完成，作者单位包括中南大学湘雅二医院及中国医科大学附属第一医院等。该研究成果发表于期刊Molecular Cancer（2024年，第23卷，第91期）。文章标题为“circ_PPAPDC1A promotes osimertinib resistance by sponging the miR-30a-3p/ IGF1R pathway in non-small cell lung cancer (NSCLC)”。

学术背景 本研究属于肿瘤分子生物学与精准治疗领域，聚焦于非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）的靶向药物耐药机制。奥希替尼（Osimertinib）作为第三代表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs），是治疗携带EGFR敏感突变（如19号外显子缺失和L858R点突变）及T790M耐药突变的NSCLC患者的一线优选药物。尽管其初始疗效显著，但几乎所有患者最终都会产生获得性耐药，中位无进展生存期约为18.9个月。目前已知的耐药机制包括EGFR C797S等新的EGFR突变、EGFR扩增、以及MET、HER2扩增等旁路激活途径，但仍约有40-50%的耐药机制尚不明确。因此，深入揭示奥希替尼耐药的新分子机制，对于开发克服耐药的新策略、改善患者预后至关重要。

环状RNA（circular RNA, circRNA）是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA分子，在多种癌症中异常表达，并扮演着重要的调控角色。它们可以充当竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA），像“海绵”一样吸附微RNA（microRNA, miRNA），从而解除miRNA对其下游靶基因的抑制作用，形成复杂的基因表达调控网络。近年来，有研究表明circRNA与NSCLC对第一、二代EGFR-TKIs的耐药相关，但其在奥希替尼耐药中的具体作用与机制研究仍很匮乏。

本研究的目的在于：筛选并鉴定在NSCLC奥希替尼获得性耐药组织中差异表达的circRNA，深入研究其功能，并阐明其促进奥希替尼耐药的具体分子机制，以期发现新的诊断标志物和治疗靶点。

研究流程详述 本研究遵循了从临床样本筛选、细胞与动物模型验证到分子机制探索的系统性研究路径，主要包括以下流程：

1. 临床样本收集与circRNA芯片分析：

   • 研究对象：收集了5例NSCLC患者配对的肿瘤组织样本，包括对奥希替尼敏感（Osimertinib Sensitive, OS）的组织，以及同一患者后续产生奥希替尼获得性耐药（Osimertinib Resistant, OR）的组织。所有患者均先接受吉非替尼一线治疗，耐药后经检测发现T790M突变，再接受奥希替尼二线治疗，最终发生耐药。样本收集经中南大学湘雅二医院医学伦理委员会批准，并获取患者知情同意。
   • 样本处理与研究：从这些配对的OS和OR组织中提取总RNA，并使用RNase R酶消化去除线性RNA，从而富集circRNA。
   • 实验方法：将富集后的circRNA进行荧光标记，与人类circRNA芯片进行杂交，通过芯片扫描获取表达谱数据。
   • 数据分析与筛选：对芯片数据进行生物信息学分析，包括标准化、差异表达分析。设定筛选标准为倍数变化（Fold Change, FC）≥ 2且p值 < 0.05。结果共鉴定出468个差异表达circRNA，其中242个在OR组织中上调，226个下调。通过生成热图、散点图和火山图进行可视化。进一步对差异circRNA的宿主基因进行基因本体（Gene Ontology, GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。最终，结合表达倍数、原始信号强度及文献调研，筛选出上调最显著的circRNA之一——hsa_circRNA_100696（根据其宿主基因PPAPDC1A，命名为circ_PPAPDC1A）进行后续验证。

2. circ_PPAPDC1A表达验证与细胞模型构建：

   • 研究对象：人正常肺上皮细胞EAS-2B、奥希替尼敏感的NSCLC细胞系（PC9, HCC827）及其对应的通过长期药物刺激筛选建立的奥希替尼耐药细胞系（PC9/OR, HCC827/OR）。PC9/OR和HCC827/OR细胞经证实存在MET基因扩增。
   • 实验方法：
     • 表达验证：采用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）验证circ_PPAPDC1A在不同细胞系中的表达水平。使用CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验检测细胞对奥希替尼（AZD9291）的敏感性，计算半数抑制浓度（IC50）。
     • 亚细胞定位：采用荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）技术确定circ_PPAPDC1A在细胞内的分布。
     • 功能模型构建：设计并构建了circ_PPAPDC1A的过表达和敲减（shRNA）慢病毒载体，分别稳定转染至PC9、HCC827、PC9/OR和HCC827/OR细胞中，成功建立circ_PPAPDC1A表达上调或下调的稳转细胞系。

3. circ_PPAPDC1A在体外的功能研究：

   • 研究对象：上述构建的circ_PPAPDC1A过表达或敲减的PC9/OR和HCC827/OR细胞，以及对应的阴性对照细胞。
   • 实验方法与处理：在给予或不给予奥希替尼（0.5 μM）处理的条件下，对细胞进行一系列功能学实验：
     • 增殖与耐药性：CCK-8实验检测细胞活力和药物敏感性。
     • 克隆形成能力：软琼脂克隆形成实验（Soft Agar Colony Formation Assay）评估细胞的锚定非依赖性生长能力。
     • DNA合成：EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷）染色实验检测细胞DNA合成活性。
     • 侵袭与迁移：基质胶侵袭实验（Matrigel Invasion Assay）评估细胞侵袭能力；划痕愈合实验（Wound Healing Assay）评估细胞迁移能力。
     • 细胞凋亡：膜联蛋白V/碘化丙啶（Annexin V/PI）双染色流式细胞术检测细胞凋亡率。

4. 分子机制探索：circ_PPAPDC1A作为ceRNA吸附miRNA：

   • 生物信息学预测：使用Arraystar软件预测可能与circ_PPAPDC1A结合的miRNA，筛选出排名前五的候选miRNA。
   • 表达验证与筛选：通过RT-qPCR在配对OS/OR组织中验证这五个候选miRNA的表达水平。发现miR-30a-3p在OR组织中下调最显著，且与circ_PPAPDC1A表达呈负相关趋势，因此选定其为后续研究目标。
   • 结合验证：
     • 双荧光素酶报告基因实验（Dual-Luciferase Reporter Assay）：构建含有circ_PPAPDC1A野生型（WT）或突变型（MUT）潜在结合序列的报告基因载体，与miR-30a-3p模拟物（mimic）或阴性对照共转染HEK293T细胞，检测荧光素酶活性变化，直接验证两者结合的特异性。
     • 功能验证：在circ_PPAPDC1A过表达或敲减的细胞中检测miR-30a-3p的表达变化。

5. 下游靶基因鉴定与信号通路研究：

   • 靶基因预测与验证：
     • 预测：联合使用miRWalk、TargetScan和miRanda数据库预测miR-30a-3p的靶基因，重点关注了与肿瘤相关的胰岛素样生长因子1受体（Insulin-like Growth Factor 1 Receptor, IGF1R），其预测评分较高。
     • 表达验证：通过RT-qPCR和蛋白质免疫印迹（Western Blot）在OS/OR组织和细胞中验证IGF1R在mRNA和蛋白水平的表达。
     • 结合验证：构建含有IGF1R 3‘非翻译区（3’UTR）野生型或突变型结合位点的报告基因载体，通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a-3p与IGF1R的直接靶向关系。
     • 功能调控：在过表达或抑制miR-30a-3p的细胞中，检测IGF1R的表达变化。
   • 信号通路验证：
     • 通路激活检测：通过Western Blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路关键蛋白（总蛋白及磷酸化蛋白）的表达水平，分析circ_PPAPDC1A/miR-30a-3p轴对该通路的调控作用。
   • 挽救实验（Rescue Assay）：
     • 在circ_PPAPDC1A过表达的PC9/OR细胞中，共转染miR-30a-3p mimic；在circ_PPAPDC1A敲减的HCC827/OR细胞中，共转染miR-30a-3p抑制剂（inhibitor）。然后重复进行CCK-8、克隆形成、侵袭、凋亡以及IGF1R和通路蛋白表达的检测，以验证miR-30a-3p是否能够逆转circ_PPAPDC1A引起的表型变化。

6. 体内动物实验验证：

   • 研究对象：裸鼠皮下移植瘤模型。将稳定转染了对照载体、circ_PPAPDC1A过表达载体或敲减载体的PC9/OR和HCC827/OR细胞注射到裸鼠腋下。
   • 处理与研究：小鼠在成瘤后接受奥希替尼治疗。定期测量肿瘤体积，绘制生长曲线。5周后处死小鼠，称量瘤重。
   • 组织学分析：对肿瘤组织进行免疫组织化学染色检测细胞增殖标志物Ki-67的表达；进行TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）实验检测细胞凋亡。

7. 数据分析方法：

   • 所有体外实验均独立重复至少三次。数据以均值±标准差表示。使用SPSS 18.0或GraphPad Prism 7软件进行统计分析。两组间比较采用非配对双尾Student’s t检验，配对样本比较采用配对双尾Student‘s t检验。相关性分析采用Spearman’s rho检验。p值 < 0.05被认为具有统计学显著性。

主要研究结果 本研究取得了一系列从现象到机制的系统性发现：

1. circ_PPAPDC1A在奥希替尼耐药NSCLC中显著上调：

   • circRNA芯片分析显示，circ_PPAPDC1A在OR组织中表达上调超过8倍，是上调最显著的circRNA之一。RT-qPCR验证了芯片结果的可靠性。
   • 在细胞水平上，circ_PPAPDC1A在耐药细胞系（PC9/OR, HCC827/OR）中的表达显著高于其亲本敏感细胞系（PC9, HCC827）。FISH实验证实其主要定位于细胞质，这为其发挥ceRNA功能提供了基础。

2. circ_PPAPDC1A促进奥希替尼耐药并增强细胞恶性表型：

   • 功能实验表明，过表达circ_PPAPDC1A能降低PC9和PC9/OR细胞对奥希替尼的敏感性，而敲减circ_PPAPDC1A则能增强HCC827/OR细胞对奥希替尼的敏感性，部分逆转耐药。
   • 在奥希替尼存在下，过表达circ_PPAPDC1A能显著促进PC9/OR细胞的增殖（CCK-8、EdU）、克隆形成（软琼脂）、侵袭（Transwell）和迁移（划痕）能力，同时抑制细胞凋亡（Annexin V/PI）。敲减circ_PPAPDC1A则对HCC827/OR细胞产生相反的效果。这些结果在体外确证了circ_PPAPDC1A的促耐药和促癌作用。

3. circ_PPAPDC1A作为分子海绵吸附miR-30a-3p：

   • 生物信息学预测和RT-qPCR筛选共同锁定miR-30a-3p为circ_PPAPDC1A的潜在靶向miRNA，且在OR组织中下调最明显。
   • 双荧光素酶报告基因实验证实，miR-30a-3p mimic能特异性降低含有circ_PPAPDC1A野生型结合位点的报告基因活性，而对突变型无效，直接证明了两者结合。
   • 功能上，过表达circ_PPAPDC1A会降低细胞内miR-30a-3p水平，敲减则使其升高，表明circ_PPAPDC1a负调控miR-30a-3p。

4. miR-30a-3p发挥抑癌作用，其靶基因为IGF1R：

   • 功能实验显示，过表达miR-30a-3p mimic能提高PC9/OR细胞对奥希替尼的敏感性，抑制其克隆形成和侵袭，并促进凋亡；而抑制miR-30a-3p则产生相反效果，证明miR-30a-3p在耐药背景下是一个抑癌因子。
   • 生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验证实，IGF1R是miR-30a-3p的直接靶基因。
   • RT-qPCR和Western Blot显示，在OR组织和细胞中，IGF1R的mRNA和蛋白水平均显著上调。过表达miR-30a-3p能抑制IGF1R表达，抑制miR-30a-3p则增强其表达。

5. circ_PPAPDC1A通过miR-30a-3p/IGF1R轴激活PI3K/AKT/mTOR通路：

   • Western Blot结果表明，过表达circ_PPAPDC1A能上调IGF1R蛋白，并激活其下游的PI3K/AKT/mTOR信号通路（表现为p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白水平升高）。敲减circ_PPAPDC1A则抑制该通路。
   • 关键的挽救实验证明，在circ_PPAPDC1A过表达的细胞中同时过表达miR-30a-3p，可以逆转由circ_PPAPDC1A引起的IGF1R上调、PI3K/AKT/mTOR通路激活、细胞增殖侵袭增强以及凋亡抑制等表现。同样，在circ_PPAPDC1A敲减的细胞中抑制miR-30a-3p，也能逆转敲减带来的效应。这形成了一个完整的证据链，确立了 “circ_PPAPDC1A → 吸附miR-30a-3p → 解除对IGF1R的抑制 → 激活PI3K/AKT/mTOR通路 → 导致奥希替尼耐药” 的分子轴。

6. 体内实验证实circ_PPAPDC1A的促耐药作用：

   • 裸鼠皮下成瘤实验显示，过表达circ_PPAPDC1A的耐药细胞形成的肿瘤生长更快、体积更大、重量更重；而敲减circ_PPAPDC1A则抑制肿瘤生长。
   • 肿瘤组织分析表明，过表达组Ki-67阳性细胞比例增高、TUNEL阳性细胞（凋亡细胞）比例降低；敲减组则相反。这与体外实验结果一致，从在体水平证实了circ_PPAPDC1A能促进肿瘤增殖、抑制凋亡，从而降低奥希替尼的治疗效果。

研究结论 本研究首次系统性地揭示并证实了circ_PPAPDC1A在NSCLC奥希替尼获得性耐药中扮演着关键致癌角色。其通过充当ceRNA，高效吸附miR-30a-3p，解除了miR-30a-3p对其靶基因IGF1R的抑制作用，进而激活IGF1R及其下游的PI3K/AKT/mTOR信号通路，最终导致奥希替尼耐药。circ_PPAPDC1A/miR-30a-3p/IGF1R轴构成了一个新颖的奥希替尼耐药调控网络。

研究价值 * 科学价值：本研究不仅发现了一个全新的与奥希替尼耐药相关的circRNA分子标志物（circ_PPAPDC1A），还深入阐明了其通过ceRNA机制调控已知耐药通路（IGF1R/PI3K/AKT/mTOR）的详细分子路径，丰富了对NSCLC靶向耐药，特别是第三代EGFR-TKI耐药机制的认识，为非编码RNA在肿瘤耐药领域的研究提供了重要范例。 * 应用价值：circ_PPAPDC1A有望成为预测NSCLC患者奥希替尼疗效和监测耐药发生的潜在新型诊断生物标志物。更重要的是，针对circ_PPAPDC1A或其调控轴（如开发靶向该circRNA的抑制剂或恢复miR-30a-3p功能的策略）可能为克服或逆转奥希替尼耐药提供全新的治疗思路和干预靶点，具有重要的临床转化潜力。

研究亮点 1. 创新性发现：首次报道了circ_PPAPDC1A在NSCLC奥希替尼耐药中的关键作用，并完整解析了其作为ceRNA的分子机制，是该研究的核心创新点。 2. 系统性与严谨性：研究从临床样本筛选出发，经过细胞、动物多层次功能验证，再到分子机制深度探索（包括预测、结合验证、通路分析、关键挽救实验），构成了一个完整、逻辑严密的证据体系，结论可靠。 3. 临床相关性