日本东京农业大学（Tokyo University of Agriculture and Technology）、横滨国立大学（Yokohama National University）、蒙古国立大学（National University of Mongolia）、甲南大学（Konan University）等机构的研究人员（包括主要作者 Keisuke Shimizu, Ryuji Kawano 等人）在期刊 Nature Nanotechnology 上于2022年1月发表了题为“用于单分子检测的从头设计纳米孔：整合β-发夹肽”的原创研究论文。
这项研究属于合成生物学、纳米技术和生物物理学交叉领域，核心目标是通过“从头设计”策略创建一种完全人工合成的、具有可控孔径的蛋白质纳米孔。研究的背景在于，根据安芬森法则，蛋白质的氨基酸线性序列决定了其三维结构和功能。自然界存在的成孔蛋白质（如α-溶血素）虽然已被广泛用于纳米孔传感技术，但其孔径和化学性质相对固定，限制了其检测不同尺寸和目标物的能力。因此，从头设计人工成孔肽，能够按需定制孔径和形状，对于扩展纳米孔传感的应用范围（如DNA测序、蛋白质测序、小分子检测）具有重大意义。本研究旨在：1）设计并合成一种能够自组装形成跨膜β-桶状纳米孔的β-发夹结构肽（命名为SV28）；2）验证其形成稳定纳米孔的能力及多分散性孔径特性；3）通过重新设计实现单分散性孔径的纳米孔（SVG28）；4）展示这两种人工纳米孔在检测双链DNA、G-四链体DNA结构以及多肽链方面的应用潜力。
研究的详细工作流程可以分为以下几个关键步骤：
第一步：肽的理性设计。研究团队首先基于跨膜β-桶状蛋白的结构特征，设计了总长度为28个氨基酸的β-发夹肽（SV28）。设计策略包含三个层次：1）构建两亲性β-链骨架：采用亲水性丝氨酸（Ser）和疏水性缬氨酸（Val）交替排列，形成一面亲水、一面疏水的β-片层，亲水面预期朝向孔内，疏水面朝向脂膜。2）利用“浮潜效应”稳定跨膜状态：在靠近脂膜-水界面的位置（第4、12、18、26位）引入酪氨酸（Tyr），其芳香环有助于稳定肽在膜中的取向。3）通过末端电荷控制肽的取向：在β-转角区域引入带负电的天冬氨酸（Asp）和丝氨酸（Ser）序列（-DSDG-），在N端和C端分别引入带正电的精氨酸-甘氨酸（RG-）和甘氨酸-精氨酸（-GR），以便在施加电压时控制肽的排列方向，促进形成反平行β-片层。最终序列为：N-RGYSVSVDSDGSVVSYRGYSVSVGR-C。
第二步：肽的合成与结构验证。由于设计的肽序列易于聚集，传统固相合成困难。研究采用了新颖的“异酰基二肽”化学合成方法，先合成水溶性的前体形式，然后在碱性条件下通过酰基迁移转化为最终的活性肽链。通过圆二色谱（CD）证实，转化后的SV28在脂质体环境中呈现出典型的β-片层结构特征（在216 nm处出现负Cotton效应）。进一步的固态核磁共振（ssNMR）技术，特别是旋转回波双共振（REDOR）实验，测定了肽链中Val10的羰基碳与Val22的酰胺氮之间的距离约为4.4 Å，这直接证明了β-链间形成了氢键，从而确认了β-发夹结构的形成。
第三步：分子动力学模拟预测与验证。研究使用GROMACS软件和CHARMM36力场进行了全原子分子动力学模拟，以预测和验证肽的行为。模拟显示：1）SV28单体在脂双层中能保持β-发夹构象。2）多个SV28单体可以组装形成稳定的跨膜β-桶状结构，如5聚体、7聚体、11聚体和16聚体孔。模拟计算了这些孔的直径，例如5聚体平均直径约1.0 nm，11聚体约2.85 nm，并观察到结构在整个模拟时间尺度（如1000 ns）内保持稳定。模拟结果为后续实验观察到的多分散性孔径提供了理论依据。
第四步：纳米孔形成与电生理学表征。研究使用微装置液滴接触法形成平面脂双层，并在其中加入SV28肽，通过膜片钳技术记录通道电流。初始条件下，SV28形成的孔电流信号不稳定且形态多样。通过系统优化条件：包括提高施加电压（至+200 mV）以对齐带电荷的肽单体、将肽与脂质/正癸烷混合液预先孵育24小时（37°C）以促进寡聚体形成、以及在脂双层中添加20%胆固醇以降低膜流动性，最终将稳定孔形成（表现为“阶梯”和“方波顶部”型电流信号）的比例从3%大幅提高到67%。对稳定孔的开孔电导进行统计分析，发现柱状图呈现五个明显的峰，对应电导值约为1.1, 3.3, 7.0, 10.5, 14.4 nS。通过将这些电导值与已知结构的天然β-桶状跨膜蛋白（如OmpA, OmpF, VDAC等）的电导-孔径关系进行比对，推算出SV28可以形成五种主要尺寸的纳米孔，其直径分别约为1.7, 3.0, 4.4, 5.4, 6.3 nm，对应的单体数量约为7, 10, 13, 16, 18个。这证实了SV28能够自组装形成多分散性尺寸的纳米孔。
第五步：SV28纳米孔的应用测试——DNA检测。研究选取了孔径约5.4 nm的SV28孔，用于检测1千碱基对（kbp）的双链DNA（dsDNA）。实验成功观测到了dsDNA易位产生的阻塞电流信号。事件频率与dsDNA浓度（50-200 nM范围内）呈线性相关，与施加电压（40-100 mV范围内）呈指数相关，这与天然α-溶血素纳米孔的行为一致。此外，研究还利用更大的SV28孔（约6.3 nm）成功检测并区分了具有G-四链体（G-quadruplex, G4）二级结构的人类端粒DNA与其线性序列。G4结构易位产生的阻塞电流幅度（~669 pA at 100 mV）显著大于相同长度线性DNA的阻塞幅度，其比值与两者分子体积的比值大致相符，证明了SV28孔具备基于尺寸和形状差异的分辨能力。
第六步：重新设计以实现单分散性孔径（SVG28）及多肽检测。为了克服SV28孔径多分散的局限性，研究团队进行了再设计。他们在SV28的跨膜β-链中引入了一个“甘氨酸转角”（Glycine-kink，将第15位的丝氨酸突变为甘氨酸），新肽命名为SVG28。甘氨酸转角可以增加β-链的局部曲率，从而稳定特定尺寸的β-桶状结构。电生理测试表明，SVG28主要形成一种单一电导（约1.0 nS）的稳定孔，对应直径约1.7 nm（推测为7聚体），单分散性显著提高，稳定孔形成比例达到约90%，与天然α-溶血素相当。分子动力学模拟也支持SVG28形成更均一的7聚体孔。随后，研究利用这个尺寸匹配的孔（1.7 nm）成功检测了多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine, PLL）多肽链。与广泛使用的α-溶血素纳米孔相比，SVG28在检测PLL时表现出更高的信噪比和事件频率。研究者将此归因于SVG28孔口带有负电荷，与带正电的PLL之间存在有利的静电相互作用，促进了目标分子的捕获。
研究获得的主要结果包括：1）成功设计并合成了首个能够自发在脂膜中形成稳定跨膜β-桶状纳米孔的完全人工β-发夹肽（SV28）。2）通过实验和模拟证实SV28形成多分散性孔径（1.7-6.3 nm）的纳米孔，并阐明了其设计原理与结构稳定性之间的关系。3）展示了SV28孔可用于检测长链dsDNA并能区分DNA的二级结构（G4）。4）通过引入甘氨酸转角突变（SVG28），实现了单分散性小孔径（1.7 nm）纳米孔的构建。5）证明了SVG28孔在检测多肽链方面优于天然α-溶血素孔，显示出在未来的蛋白质测序应用中的潜力。
本研究的结论是，通过精简的理性设计策略（限制氨基酸种类、序列长度，并整合两亲性、浮潜效应和电荷控制等关键原则），可以实现跨膜β-桶状纳米孔的从头设计。这种人工纳米孔不仅能够模拟天然蛋白质的功能，更重要的是具备了尺寸可调和按需定制的特性。研究成功地将其应用于从大分子DNA到多肽链的单分子检测，验证了其作为新一代纳米孔传感平台的可行性。
这项研究的科学价值和应用价值显著。在科学上，它突破了传统蛋白质工程对天然模板的依赖，展示了从一级序列出发直接构建具有复杂组装功能和跨膜结构的人工蛋白质的能力，是对“序列决定结构”这一核心生物学原理的成功实践与扩展。在应用上，本研究为纳米孔传感技术提供了高度可定制的“硬件”基础。与天然或工程化的生物纳米孔相比，人工设计的肽纳米孔在尺寸、形状、表面化学性质上具有前所未有的可设计性，有望被“量身定制”用于检测各种特定的目标分子，包括目前难以用现有纳米孔检测的分子，从而极大地拓宽纳米孔技术在生物传感、诊断、DNA/蛋白质测序等领域的应用范围。特别是SVG28在多肽检测上的优异表现，为开发低成本、高通量的单分子蛋白质测序技术开辟了新途径。
本研究的亮点在于：1）创新性的设计策略：将跨膜蛋白结构的多重稳定原理（两亲性、界面芳香族残基、电荷导向）集成到一个简短的28肽设计中，逻辑清晰且高效。2）多学科方法验证：结合了计算化学（MD模拟）、合成化学（异酰基二肽法）、结构生物学（CD, ssNMR）和单分子生物物理学（电生理学）等多种尖端技术，对人工纳米孔从设计、合成、结构到功能的各个环节进行了严谨而全面的验证。3）功能导向的再设计能力：从多分散性孔（SV28）到单分散性孔（SVG28）的演变，展示了基于结构理解进行功能优化和定制的能力，这是真正“设计”能力的体现。4）成功的概念验证应用：不仅证明了成孔的基本功能，还进一步演示了其在检测DNA二级结构和多肽等实际目标物方面的效能，将基础设计与实际应用紧密相连。5）方法的普适性意义：研究所采用的“降低信息层级”和“限制序列空间”的设计哲学，为其他复杂功能蛋白或多肽组装体的从头设计提供了有价值的参考思路。