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利用通用型靶向CAR-T细胞同时杀伤癌细胞和癌症相关成纤维细胞
一、 研究团队与发表信息
本项研究的主要作者包括Bo Huang、SuiLan Zheng、Kasireddy Sudarshan、Ramesh Mukkamala、Madduri Srinivasarao、Tushar Sardesai、Xiaofei Yang、Haiyan Chu以及通讯作者Philip S. Low。研究团队主要来自美国普渡大学（Purdue University）化学系和药物发现研究所，其中Haiyan Chu也隶属于美国西雅图的Umoja Biopharma公司。
该研究于2025年2月17日发表在免疫学领域的开放获取期刊《Frontiers in Immunology》上，文章类型为原创性研究（Original Research），引用信息为：Huang B et al. (2025) Use of a universal targeting CAR T cell to simultaneously kill cancer cells and cancer-associated fibroblasts. Front. Immunol. 16:1539265。
二、 学术背景与研究目的
本研究的科学领域是肿瘤免疫治疗，具体聚焦于嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cell, CAR-T）疗法在实体瘤治疗中的应用。尽管CAR-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了显著成功，但在对抗实体瘤时疗效有限。研究背景指出，实体瘤微环境中的多种因素导致了这种局限性，包括CAR-T细胞对肿瘤的浸润不足、CAR-T细胞耗竭、肿瘤细胞的抗原逃逸以及免疫抑制性的肿瘤微环境。其中，癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts, CAFs）被认为是实体瘤微环境中一个关键的免疫抑制和促肿瘤成分。CAFs通过分泌免疫抑制性细胞因子（如IL-10、TGF-β）、肿瘤生长因子以及细胞外基质成分，不仅抑制药物和免疫细胞向肿瘤内部渗透，还促进肿瘤生长和转移。因此，CAFs的存在与患者总体生存率呈负相关。
针对CAFs的策略之一是利用其在实体瘤中特异性高表达的成纤维细胞激活蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP）作为靶点。然而，传统的靶向FAP的CAR-T细胞疗法面临一些挑战，例如需要为每位患者单独制备针对不同靶点的CAR-T细胞，这增加了治疗的复杂性和成本。
本研究旨在探索一种创新的解决方案：使用一种“通用型”CAR-T细胞，通过注射不同的双特异性适配器（bispecific adapter），使其能够同时靶向并杀伤肿瘤细胞和CAFs。这种通用型CAR-T细胞表达的CAR靶向荧光素（fluorescein），而非特定的肿瘤抗原。通过注射一端连接荧光素、另一端连接不同靶向配体（如靶向叶酸受体或FAP）的适配器分子，可以将CAR-T细胞引导至不同的靶细胞。本研究的主要目标是验证这种策略能否在实体瘤模型中有效且安全地同时消除癌细胞和CAFs，并探究其相较于单一靶向治疗的优越性及其作用机制。
三、 详细研究流程
本研究包含多个严谨的实验步骤，从分子设计与体外验证到体内动物模型评估，流程系统而完整。
1. 双特异性适配器的设计与评估 * 研究材料与方法：研究首先设计并合成了两种双特异性适配器。第一种是叶酸-荧光素（folate-FL）适配器，用于靶向在约40%人类癌症中过度表达的叶酸受体α（Folate Receptor Alpha, FRα）。第二种是FAP8-荧光素（FAP8-FL）适配器，用于靶向CAFs表面高表达的FAP。其中，FAP8是一种小分子FAP配体，通过一个54原子的PEG18连接子与荧光素连接。研究通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估了这两种适配器与各自靶点（FRα或FAP）以及通用型抗荧光素CAR-T细胞上CAR的结合亲和力与特异性。 * 关键技术与创新：FAP8-FL适配器的设计是本研究的创新点之一。研究人员发现，连接子的长度对于能否有效介导CAR-T细胞与靶细胞的桥接至关重要。他们通过优化，选择了PEG18这一特定长度的连接子，确保了适配器两端能同时有效结合FAP和CAR。
2. 体外细胞杀伤实验 * 研究对象与样本量：研究使用了多种细胞系进行体外杀伤实验。靶细胞包括：表达人FAP的HS894人成纤维细胞系、表达鼠FAP的3T3小鼠成纤维细胞系、以及经过基因改造表达人FAP的MDA-MB-231细胞。作为对照，使用了不表达FAP的亲本MDA-MB-231细胞。效应细胞是预先制备好的通用型抗荧光素CAR-T细胞。 * 实验流程：将靶细胞与通用型CAR-T细胞按特定效靶比（E:T ratio）共培养，并加入不同浓度的FAP8-FL适配器。孵育48小时后，通过流式细胞术计数存活靶细胞，计算细胞裂解百分比。同时，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测上清液中干扰素-γ（IFN-γ）的释放水平，以评估CAR-T细胞的激活程度。
3. 体内肿瘤模型研究 本研究建立了两种不同的体内肿瘤模型，以评估联合靶向策略在不同肿瘤微环境中的效果。 * “热”肿瘤模型（MDA-MB-231 + HS894）： * 模型构建：将表达FRα但不表达FAP的亲本MDA-MB-231人乳腺癌细胞与天然表达人FAP的HS894人成纤维细胞混合，皮下注射到免疫缺陷的NSG小鼠体内，以模拟含有CAFs的实体瘤微环境。 * 实验分组与处理：待肿瘤生长至约250 mm³后，将荷瘤小鼠分为不同治疗组：1) 仅注射CAR-T细胞（对照组）；2) CAR-T细胞 + FAP8-FL适配器（仅靶向CAFs）；3) CAR-T细胞 + folate-FL适配器（仅靶向癌细胞）；4) CAR-T细胞 + FAP8-FL + folate-FL适配器（同时靶向CAFs和癌细胞）。适配器按特定频率静脉注射。 * 观察与终点分析：定期测量肿瘤体积和小鼠体重。研究终点时，收集肿瘤组织和外周血样本。通过免疫组织化学（IHC）染色分析肿瘤切片中CAFs（抗鼠FAP抗体）、CAR-T细胞（抗人CD3抗体）和肿瘤细胞增殖标志物Ki67的分布与丰度。通过流式细胞术对消化后的肿瘤单细胞悬液进行定量分析，精确计数肿瘤内残留的CAFs和浸润的CAR-T细胞数量。同时，通过流式细胞术分析外周血中的CAR-T细胞数量，并通过ELISA检测血浆中的IFN-γ水平。
4. 数据分析方法 研究采用GraphPad Prism软件进行统计分析。肿瘤生长曲线采用双因素方差分析（two-way ANOVA）比较组间差异。对于流式细胞术、ELISA、IHC定量（使用ImageJ软件）等终点数据，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行组间比较，并标注显著性水平（*p < 0.05, **p<0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001）。数据以均值±标准差（SD）或均值±标准误（SEM）表示。
四、 主要研究结果
1. 适配器有效介导特异性结合与体外杀伤：结合亲和力实验证实，folate-FL和FAP8-FL均能以纳摩尔级的高亲和力与各自的靶抗原（FRα或FAP）以及抗荧光素CAR结合。体外杀伤实验显示，FAP8-FL能够剂量依赖性地引导通用型CAR-T细胞有效裂解表达FAP的HS894、3T3-mFAP和MDA-MB-231-hFAP细胞，并伴随高水平的IFN-γ释放，呈现出预期的“钟形”剂量-效应曲线（因适配器浓度过高会导致CAR和靶抗原位点被不同适配分子饱和，反而抑制桥接）。而对不表达FAP的亲本MDA-MB-231细胞则无杀伤作用，证明了FAP8-FL介导杀伤的靶向特异性。
2. 同时靶向CAFs和癌细胞显著增强对“热”肿瘤的抑制：在MDA-MB-231+HS894混合肿瘤模型中，与仅用CAR-T细胞或CAR-T联合单一适配器的组别相比，同时给予FAP8-FL和folate-FL适配器治疗的小鼠，其肿瘤生长得到了近乎完全的抑制，疗效最佳。重要的是，这种联合治疗并未引起小鼠明显的体重下降，提示安全性良好。机制分析表明：(1) 有效清除CAFs：流式细胞术和IHC结果一致显示，接受FAP8-FL（无论是否联合folate-FL）治疗的组别中，肿瘤内CAFs数量显著减少。(2) 增强CAR-T细胞增殖与浸润：联合治疗组小鼠肿瘤内和外周血中的CAR-T细胞数量均显著高于仅用folate-FL的组别，说明靶向CAFs不仅没有消耗CAR-T细胞资源，反而促进了其在体内的扩增和向肿瘤的募集。(3) 降低肿瘤细胞增殖：Ki67染色定量分析显示，任何包含FAP8-FL的治疗方案（即清除了CAFs）都能显著降低肿瘤细胞的增殖指数，这证实了CAFs通过分泌生长因子促进肿瘤生长的理论。
3. 双靶向策略克服CAFs屏障，有效抑制“冷”肿瘤：在难治的KB“冷”肿瘤模型中，单独使用靶向癌细胞的folate-FL或单独使用靶向CAFs的FAP8-FL均无法抑制肿瘤生长，这与该模型的耐药特性一致。然而，同时使用两种适配器进行联合治疗，则实现了约50%的肿瘤生长抑制，效果具有统计学显著性。该组小鼠的外周血IFN-γ水平最高，CAR-T细胞在肿瘤内的浸润数量也最多。IHC结果提供了关键的视觉证据：在联合治疗组，肿瘤外围由CAFs形成的致密屏障被打破，CAR-T细胞得以深入肿瘤内部均匀分布，而不仅仅是局限在边缘。同时，肿瘤细胞的Ki67表达也大幅下降。这一系列结果强有力地证明，同时清除CAFs和癌细胞能协同克服“冷”肿瘤的物理和免疫抑制屏障，重塑肿瘤微环境，使CAR-T疗法对原本耐药的肿瘤产生疗效。
4. 结果间的逻辑关系：体外实验首先验证了FAP8-FL适配器的功能可行性，为体内实验奠定了基础。体内“热”肿瘤模型的结果表明，双靶向策略在技术上是可行的，且比单一靶向更有效，并初步揭示了其增强疗效的机制（清除CAFs、促进CAR-T扩增与浸润、抑制增殖）。随后，在更具挑战性的“冷”肿瘤模型中，双靶向策略的成功应用，不仅验证了该策略的普适性，更深入揭示了其核心价值——能够破解由CAFs介导的CAR-T细胞浸润和功能抑制这一实体瘤治疗的关键瓶颈。从“热”肿瘤到“冷”肿瘤的递进研究，逻辑严密地证明了该策略的有效性和机制优势。
五、 研究结论与价值
本研究得出结论：使用单一的通用型抗荧光素CAR-T细胞，配合靶向癌细胞（FRα）和CAFs（FAP）的两种双特异性适配器，能够安全、有效地在实体瘤模型中同时清除这两种细胞类型。这种联合靶向策略不仅显著增强了在易感（“热”）肿瘤中的疗效，更能克服CAFs屏障，对原本耐药的免疫学“冷”肿瘤产生抑制效果。
科学价值：本研究为实体瘤CAR-T疗法提供了一个新颖且灵活的平台性策略。它证明了利用一种通用型CAR-T细胞执行多重任务（同时攻击肿瘤实质细胞和基质细胞）的可行性，并且这种“分工”不仅不会削弱其效能，反而通过改变免疫抑制微环境产生了协同增效作用。这为理解并干预肿瘤微环境以增强免疫治疗提供了新的实验依据。
应用价值： 1. 安全性：在动物模型中未观察到显著毒性，表明选择性靶向肿瘤相关FAP可能具有较好的治疗窗口。 2. 成本效益与可扩展性：只需制备一种通用型CAR-T细胞，即可通过更换或组合不同的适配器来应对不同的肿瘤抗原或肿瘤微环境成分，避免了为每个新靶点单独开发和生产CAR-T细胞的巨大成本和复杂性，使治疗更具可扩展性和个性化潜力。 3. 克服耐药性：该策略为治疗富含基质、对传统免疫疗法不敏感的“冷”肿瘤提供了新的思路。 4. 可调控性：适配器的浓度和给药频率可以调节，这为控制CAR-T细胞活性、避免细胞因子释放综合征（CRS）和T细胞耗竭提供了额外的安全调控手段。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究在讨论部分还提出了该策略未来的扩展可能性。例如，理论上可以进一步开发靶向其他免疫抑制性细胞（如调节性T细胞、髓源性抑制细胞、肿瘤相关巨噬细胞等）的适配器，从而对肿瘤微环境进行更全面的“重编程”。此外，作者也客观指出了潜在的挑战，例如在将此类基于人类T细胞的疗法推向临床时，需要在免疫健全的动物模型中进一步验证其安全性和有效性，以排除潜在的免疫原性问题。同时，作者也提及了由于FAP在组织损伤修复中可能起作用，对于伴有组织创伤的癌症患者，使用FAP靶向疗法时可能需要考虑治疗时机。最后，作者指出适配器疗法的“钟形”剂量效应曲线虽然增加了剂量优化的复杂性，但也为通过人工智能分析大数据，实现真正个性化的适配器组合、浓度和给药方案提供了可能。