本研究由来自伊朗阿瓦士贾迪沙普尔大学医学科学院的Nazanin Joudaki, Mohammad Rashno, Ali Asadirad以及通讯作者Ali Khodadadi（同时隶属于该校癌症研究中心）共同完成，其成果以题为《Role of breast cancer-derived exosomes in metabolism of immune cells through PD1-Glut1-HK2 metabolic axis》的论文形式，于2021年发表在学术期刊《Tissue and Cell》（第71卷，文章ID 101576）上。
从学术背景来看，这项研究隶属于肿瘤免疫学与细胞代谢的交叉领域。癌症是全球最主要的致死疾病之一，而乳腺癌是女性中最常见的癌症类型。肿瘤细胞能够通过多种机制逃避免疫系统的监视和攻击，这是癌症治疗失败的关键原因之一。其中，肿瘤来源的外泌体（exosomes）——一种由细胞分泌的纳米级囊泡，被证明在调节免疫反应、塑造肿瘤微环境中扮演着重要角色。与此同时，免疫细胞的功能状态与其代谢程序密切相关。例如，在肿瘤微环境中，T细胞可能转变为功能耗竭（exhausted）状态，其特征之一是程序性死亡蛋白1（Programmed cell death protein 1， PD-1）等抑制性受体表达上调。PD-1与其配体PD-L1结合后发出的信号，会抑制T细胞内的糖酵解（glycolysis）途径，具体表现为降低葡萄糖转运蛋白1（Glucose transporter 1， Glut1）和己糖激酶2（Hexokinase 2， HK2）的表达，从而削弱免疫细胞的活性和杀伤能力，这条调控通路被称为PD1-Glut1-HK2代谢轴。然而，关于乳腺癌来源的外泌体是否以及如何通过影响PD1-Glut1-HK2轴来改变免疫细胞的代谢，此前尚不明确。因此，本研究旨在探究乳腺癌细胞系及患者血清来源的外泌体，对外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells， PBMCs）中PD1、Glut1及HK2基因表达的影响，以期阐明乳腺癌外泌体在免疫细胞代谢重编程中的作用。
研究的工作流程设计严谨，包含多个连续的实验环节，可详细阐述如下。
首先，是外泌体的来源获取与表征。研究使用了两种来源的外泌体：一是从三到四期且未接受过化疗的乳腺癌患者（共10例，人口统计学数据见表1）的血清中提取；二是从人乳腺癌MDA-MB-231细胞系的条件培养基中提取。细胞在培养过程中逐步适应无血清培养基，以确保收集的外泌体不受胎牛血清中外泌体的污染。两种来源的外泌体均使用商业试剂盒（血清样本用ExoQuick，细胞系样本用ExoSpin）进行分离纯化。随后，研究团队对外泌体进行了系统表征：1）使用动态光散射（Dynamic Light Scattering， DLS）测量颗粒直径，结果显示MDA-MB-231细胞系来源外泌体90%的颗粒直径为89.6纳米，患者血清来源外泌体90%的颗粒直径为77.7纳米；2）使用原子力显微镜（Atomic Force Microscopy， AFM）观察形态，确认两者均为球形，直径范围在40-200纳米之间，符合外泌体的典型特征；3）使用BCA蛋白测定法对分离得到的外泌体进行蛋白定量，细胞系来源外泌体浓度为5毫克/毫升，血清来源为1毫克/毫升。这些表征数据确保了后续实验所用材料的可靠性。
其次，是靶细胞的分离与处理。研究从健康供者的静脉血中，使用密度梯度离心法分离出PBMCs作为免疫细胞的模型。将PBMCs以每孔100万个细胞的密度培养后，分为三组进行干预：实验组一用100微克/毫升浓度的MDA-MB-231细胞系来源外泌体处理；实验组二用100微克/毫升浓度的乳腺癌患者血清来源外泌体外泌体处理；对照组则不进行任何处理。所有细胞均在37°C、5% CO2条件下培养72小时。
第三，是基因表达水平的检测与分析。处理72小时后，从各组细胞中提取总RNA，并反转录合成cDNA。采用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）技术，以β-肌动蛋白（ACTB）基因作为内参，检测PBMCs中PD1、Glut1和HK2基因的相对表达量。研究中使用的引物序列（见表2）参考了已发表的文献，并通过LinRegPCR软件计算了各引物的扩增效率（均在1.85至1.89之间，见表3），并检查了熔解曲线以确保反应的特异性。所有Ct值结果使用GraphPad Prism 8软件，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计学处理，以P值小于0.0001为具有统计学显著性差异。
本研究的主要结果逐项呈现，逻辑链条清晰。
关于外泌体表征的结果如前所述（图1和图2），为实验的可行性奠定了基础。实时定量PCR的引物效率结果（表3）则表明检测体系稳定可靠。
最关键的是基因表达分析的结果（图3）。在处理后的PBMCs中：1）HK2基因的表达在两个实验组中均发生了显著变化。与对照组相比，无论是用MDA-MB-231细胞系外泌体还是患者血清外泌体处理的PBMCs，其HK2基因的相对表达量均显著升高（P < 0.0001）。而且，这两个实验组之间的HK2表达水平没有显著差异（P = 0.9637）。这表明两种来源的乳腺癌外泌体都能一致性地诱导免疫细胞中这个关键糖酵解酶基因的表达上调。2）Glut1基因的表达变化因外泌体来源不同而异。只有在用MDA-MB-231细胞系外泌体处理的组中，Glut1基因的表达才显著高于对照组（P < 0.0001）。而在用患者血清外泌体处理的组中，虽然表达量有所上升，但与对照组相比未达到统计学显著性（P = 0.2020）。此外，细胞系外泌体处理组中Glut1的表达水平显著高于血清外泌体处理组（P < 0.001）。3）PD1基因的表达模式与Glut1类似。同样，仅在MDA-MB-231细胞系外泌体处理组中，PD1基因的表达量相比对照组显著增加（P < 0.0001）。患者血清外泌体处理组与对照组之间则无显著差异（P = 0.7919）。并且，细胞系外泌体处理组的PD1表达水平显著高于血清外泌体处理组（P < 0.0001）。
这些结果之间的逻辑关系指向了重要的生物学推论。HK2和Glut1是糖酵解途径中的关键分子，它们的表达上调通常意味着细胞糖酵解活动的增强。本研究发现，两种乳腺癌外泌体都能显著提高HK2的表达，而细胞系外泌体还能同时上调Glut1的表达。这强有力地表明，乳腺癌外泌体能够促进PBMCs的糖酵解代谢。这一发现与先前一些研究（如白血病或胶质母细胞瘤外泌体能增强其他细胞糖酵解）的结论相呼应，但本研究的创新点在于将这种现象与乳腺癌及特定的PD1-Glut1-HK2代谢轴联系起来。
更具启发性的结果是关于PD1的表达。传统观点认为，PD1信号会抑制Glut1和HK2的表达，从而抑制糖酵解。然而在本研究中，MDA-MB-231细胞系外泌体在诱导Glut1和HK2表达显著上升的同时，也诱导了PD1的表达显著上升。这意味着，在这种由外泌体诱导的代谢重编程场景下，PD1表达的增加并没有像经典理论描述的那样起到抑制糖酵解关键基因的作用。研究者推测，这可能是由于乳腺癌来源的外泌体使得PD1-Glut1-HK2这条代谢调控轴“失活”了，或者说该轴未能被正常激活，从而导致PD1的抑制功能“失效”。这为理解肿瘤微环境中免疫代谢的复杂性提供了新的视角。
此外，研究结果还显示，MDA-MB-231细胞系来源的外泌体在诱导Glut1和PD1基因表达变化方面，比患者血清来源的外泌体效力更强。研究者对此现象给出了合理解释：患者血清中含有来自体内多种细胞的外泌体，成分更为复杂，纯度相对较低；而细胞系来源的外泌体均出自同一种癌细胞，来源单一且纯净，可能更贴近于肿瘤微环境中外泌体的原始状态。同时，分离过程中使用的不同试剂盒也可能对纯度造成影响。
基于以上工作流程和结果，本研究得出结论：乳腺癌来源的外泌体能够改变免疫细胞（以PBMCs为模型）的代谢程序，特别是可以上调糖酵解途径中关键酶（HK2）和转运蛋白（Glut1）的基因表达，从而潜在地增强免疫细胞的糖酵解代谢活动。一个突破性的发现是，在此过程中，抑制性受体PD1的表达也可能被外泌体诱导上调，但这种上调并未能像以往研究中那样抑制糖酵解相关基因的表达，提示了在乳腺癌外泌体影响下，PD1-Glut1-HK2代谢轴的功能可能发生了异常或重编程。相比之下，细胞系来源的外泌体在模拟肿瘤微环境效应方面可能比成分混杂的血清外泌体更具代表性。
这项研究的科学价值显著。首先，它将肿瘤外泌体、免疫代谢和免疫检查点分子PD1三者联系在一个具体的研究框架内，深化了人们对肿瘤如何通过外泌体介导的远程通信来系统性调控免疫系统功能的理解。其次，研究发现了PD1表达与糖酵解基因表达在特定条件下可以“脱钩”的现象，这对经典的PD1抑制糖酵解的理论是一个重要补充，揭示了肿瘤免疫代谢调控网络的复杂性和情境依赖性。在应用价值方面，该研究为开发针对肿瘤外泌体或相关代谢通路的新型免疫治疗策略提供了潜在靶点和理论依据。例如，若能阻断肿瘤外泌体对免疫细胞代谢的这种重编程作用，或许能恢复或增强免疫细胞在肿瘤微环境中的抗肿瘤功能。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：1）重要的发现：揭示了乳腺癌外泌体能够同时上调免疫细胞中PD1和糖酵解关键基因的表达，挑战了PD1必然抑制糖酵化的传统认知，提出了该代谢轴功能可能“失效”的新观点。2）严谨的对照设计：同时使用了乳腺癌细胞系外泌体和临床患者血清外泌体进行平行实验，既能探索机制，又能联系临床实际，并通过对两者效应差异的分析，深化了对实验模型的认识。3）系统性的表征与验证：对外泌体进行了粒径、形态、浓度等多维度表征，并使用实时定量PCR对目标基因进行了精确量化，确保了实验数据的可靠性。4）研究对象的特殊性：聚焦于乳腺癌这一高发癌症类型，并专门研究了其外泌体通过PD1-Glut1-HK2这一特定代谢轴对免疫细胞的影响，具有明确的疾病和通路针对性。
最后，研究者在讨论部分还提及了与本研究相关的其他有价值的内容，例如其他类型癌症（如急性髓系白血病、胶质母细胞瘤）的外泌体也被证明能通过增强糖酵解来影响受体细胞，肿瘤外泌体可以诱导M2型肿瘤相关巨噬细胞的形成（其标志之一也是糖酵解增强），以及外泌体可能直接携带PD1分子或传递其生成程序给免疫细胞等。这些背景信息支持了本研究发现的可信度，并将其置于更广阔的肿瘤外泌体研究图景中。文章末尾，作者建议未来研究可以进一步探索与糖酵解相关的其他代谢通路，以及癌细胞外泌体对免疫细胞不同代谢途径的广泛影响，为后续研究指明了方向。