学术研究报告：CD300LD通过结合CD8+ T细胞上的磷脂酰丝氨酸介导病理性活化中性粒细胞驱动肿瘤免疫抑制
第一， 研究作者、机构与发表信息 本研究由Chaoxiong Wang, Peixuan Zheng, Anhui Wang, Xinrui Fan, Tianxiang Li, Jingjing Hong, Runze Wang, Chunyan Zhang, Chaogui Luo, Weiwei Yang, Dong Gao, Adili Salai, Min Luo, Zhigang Lu, Dianfan Li, Moubin Lin, Jiayin Peng, Guohui Li, Shuo Han, 及 Yun Zhao 等多位作者合作完成，作者单位包括中国科学院分子细胞科学卓越中心等多个国内外研究机构。该研究论文于2026年4月9日被接受，发表于国际顶级期刊 Nature Cancer。
第二， 学术背景与研究目的 本研究属于肿瘤免疫学和免疫治疗领域。免疫检查点阻断（ICB）疗法是当前癌症治疗的重要手段，但其疗效常因肿瘤免疫抑制微环境（TME）而受限。在TME中，病理性活化的中性粒细胞，也称为多形核髓系来源的抑制性细胞（PMN-MDSCs），是驱动免疫逃逸的关键因素。这些细胞主要通过诱导CD8+ T细胞功能耗竭来发挥免疫抑制作用，而这种抑制作用的发挥严重依赖于与CD8+ T细胞的直接细胞间接触。然而，介导这种细胞间相互作用的精确分子机制此前并不清楚，阻碍了针对这一免疫抑制轴开发有效策略。
该团队此前的研究发现，一种名为CD300LD的分子对于招募PMN-MDSCs进入肿瘤并抑制T细胞活化至关重要。但CD300LD的配体未知，这阻碍了对其他免疫抑制活性机制的理解。本研究的核心目的在于：1）鉴定CD300LD的功能性配体；2）阐明CD300LD如何介导PMN-MDSCs与CD8+ T细胞之间的接触依赖性抑制；3）评估靶向这一相互作用作为克服免疫治疗耐药新策略的可行性。研究的最终目标是揭示并验证一个可靶向的免疫检查点通路，以改善免疫治疗效果。
第三， 详细研究流程与方法 本研究流程复杂且环环相扣，可概括为以下几个核心阶段：
1. 鉴定CD300LD的配体——磷脂酰丝氨酸（PS） * 研究对象与方法： 研究首先利用AlphaFold3人工智能蛋白质结构预测模型，对CD300LD胞外区与114种脂质分子的相互作用进行了大规模计算机模拟筛选。同时，构建并表达了小鼠CD300LD胞外区与Fc的融合蛋白（CD300LD-ECD-Fc），用于后续生化验证。 * 实验验证： 通过脂质斑点印迹、脂质体沉降实验、表面等离子体共振（SPR）技术等一系列体外生化实验，证实了CD300LD-ECD-Fc能够特异性地、钙离子依赖性地结合磷脂酰丝氨酸（PS），而非其他预测亲和力高的脂质（如磷脂酰乙醇胺PE）。竞争性SPR实验表明，已知的PS结合蛋白Annexin V能够阻断CD300LD与PS的结合。此外，利用凋亡细胞和荧光标记的PS脂质体进行的细胞结合实验进一步证明，表达CD300LD的细胞（如293T细胞和原代小鼠中性粒细胞）结合PS的能力显著强于对照组。 * 结构基础解析： 通过AlphaFold3建模结合分子动力学（MD）模拟，研究人员预测了CD300LD与PS结合的分子模型。模拟发现，关键残基如R60和D116通过盐桥与PS头部基团结合，K112和G114则与PS的磷酸基团协同一个钙离子以稳定复合物。此外，C62处的二硫键有助于维持结合口袋的开放构象。随后的定点突变结合实验（将C62或D116突变为丙氨酸）证实，这些突变完全废除了CD300LD的PS结合能力，而不影响整体蛋白结构稳定性，从而确定了PS结合的结构基础。
2. 验证CD300LD-PS相互作用在肿瘤进展中的功能 * 体内肿瘤模型： 研究使用了多种小鼠肿瘤模型，包括B16-F10黑色素瘤、TC-1宫颈癌、MC38结肠癌、Renca肾癌以及自发性的肝癌（HCC）模型。 * 功能丧失实验： * 竞争性阻断： 在荷瘤野生型小鼠体内注射Annexin V或靶向PS的抗体（Bavituximab）以竞争性阻断CD300LD与PS的结合，观察到了显著的肿瘤生长抑制和肿瘤微环境重塑（PMN-MDSCs减少，CD8+ T细胞增多）。而在CD300LD敲除（KO）小鼠中，这种抑制效果大幅减弱。 * 功能丧失性突变体治疗： 给荷瘤小鼠注射不能结合PS的CD300LD突变体（C62A或D116A）蛋白，发现其失去了野生型CD300LD蛋白所具有的促进肿瘤生长、抑制免疫细胞浸润的作用。 * 基因敲入突变小鼠模型： 研究团队构建了CD300LD基因点突变敲入小鼠（C62A和D116A）。在这些小鼠中，中性粒细胞/PMN-MDSCs完全丧失了结合PS的能力。与野生型小鼠相比，突变小鼠在接种多种肿瘤细胞后，肿瘤生长显著减缓，肿瘤内PMN-MDSCs浸润减少，而CD8+ T细胞浸润增加。在自发性肝癌模型中，突变小鼠也表现出更轻的肝脏肿瘤负荷和更长的生存期。 * 体外抑制实验： 从荷瘤小鼠脾脏分离的PMN-MDSCs，与野生型相比，来自CD300LD敲除或突变小鼠的PMN-MDSCs在体外抑制抗原特异性CD8+ T细胞增殖的能力显著下降。 * 功能获得实验： 通过构建TMEM30A（一种维持膜磷脂不对称性的蛋白）敲除的肿瘤细胞，使其细胞膜表面非凋亡性地暴露大量PS。结果表明，这类肿瘤细胞在野生型小鼠中生长更快并招募更多PMN-MDSCs，但在CD300LD敲除小鼠中这种效应消失。这证实了肿瘤细胞表面的PS可以通过CD300LD“滞留”PMN-MDSCs于肿瘤微环境中。
3. 揭示CD300LD介导PMN-MDSCs与PS高表达（PS-high）CD8+ T细胞的特异性接触 * 发现PS-high CD8+ T细胞： 研究证实，无论是体外活化还是肿瘤浸润的CD8+ T细胞，都会在未发生凋亡的情况下上调细胞膜表面的PS（PS-high状态）。这类PS-high CD8+ T细胞具有更强的活化、增殖和细胞毒性标志物表达，但同时伴随耗竭标志物上调，代表了肿瘤微环境中一群高度活化但可能被抑制的细胞毒性T细胞。 * 开发新型细胞接触示踪技术： 为了直接观察和量化PMN-MDSCs与CD8+ T细胞之间的瞬时接触，研究人员创新性地开发了一种基于细菌分选酶A（SrtA）的邻近标记系统。他们将来自猪链球菌的SrtA酶通过胆固醇修饰锚定在供体细胞（如CD8+ T细胞）膜上。当供体细胞与受体细胞（如PMN-MDSC）密切接触时，SrtA酶能将生物素标记的底物肽（LPETG）共价转移到邻近受体细胞的表面蛋白上，从而实现对发生接触的细胞进行特异性标记和流式细胞术检测。 * 接触验证实验： * 体外共培养： 利用上述SrtA系统，研究发现野生型PMN-MDSCs与PS-high的CD8+ T细胞共培养后，被生物素标记的比例显著高于与PS-low T细胞共培养，或使用CD300LD敲除的PMN-MDSCs进行共培养。添加可溶性CD300LD蛋白可以竞争性阻断这种标记。 * 体内验证： 将表达SrtA的抗原特异性CD8+ T细胞过继转移到荷瘤小鼠体内，随后注射生物素底物。结果在肿瘤浸润的PMN-MDSCs上检测到了显著的生物素信号，而在CD300LD敲除的宿主小鼠中，此信号大幅降低。这直接证明了在真实的肿瘤微环境中，PMN-MDSCs通过CD300LD与CD8+ T细胞发生了物理接触。 * 成像验证： 通过成像流式细胞术和肿瘤组织免疫荧光染色，直观地观察到了CD300LD阳性的中性粒细胞/PMN-MDSCs与CD8+ T细胞在空间上的紧密毗邻。
4. 阐明CD300LD介导的接触如何抑制PS-high CD8+ T细胞功能 * 表型分析： 分析肿瘤浸润淋巴细胞发现，在CD300LD敲除小鼠的肿瘤中，PS-high CD8+ T细胞的比例更高，且这群细胞表现出更强的效应功能（如IFN-γ, GZMB）和增殖能力（Ki67），耗竭标志物（PD-1, Tim-3）表达更低。 * 单细胞RNA测序（scRNA-seq）： 对从野生型和CD300LD敲除小鼠肿瘤中分选出的PS-high和PS-low CD8+ T细胞进行scRNA-seq分析。结果显示，来自CD300LD敲除小鼠的PS-high CD8+ T细胞中，效应和增殖性亚群比例增加，而终末耗竭亚群比例减少。轨迹分析表明，CD300LD缺失促使活化T细胞更倾向于向效应状态分化。此外，分析发现了同时表达髓系和淋巴细胞特征基因的“双细胞”事件，这些事件更多发生在PS-high T细胞与野生型背景中，提示了细胞间密切相互作用的转录组证据。 * 功能恢复实验： 体外细胞毒性实验表明，与CD300LD敲除的PMN-MDSCs共培养后，PS-high CD8+ T细胞的杀瘤能力得以更好地保留。在过继性T细胞治疗模型中，将活化CD8+ T细胞过继到同时缺乏T细胞和CD300LD（Rag1-/-Cd300ld-/-）的荷瘤小鼠体内，其抗肿瘤效果优于过继到仅缺乏T细胞（Rag1-/-）的小鼠。 * 机制探究： scRNA-seq和流式细胞术均显示，CD300LD缺失的肿瘤中，CD8+ T细胞的关键信号分子CD3ζ链的表达更高。已知PMN-MDSCs通过直接接触释放活性氧（ROS）来下调CD3ζ并诱导T细胞耐受。本研究发现，使用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）可以削弱野生型PMN-MDSCs的免疫抑制能力，使其降至与CD300LD敲除PMN-MDSCs相似的水平。这表明CD300LD介导的物理接触是PMN-MDSCs通过ROS途径发挥抑制作用的先决步骤。
5. 开发靶向CD300LD的中和抗体并评估其治疗效果 * 抗体开发： 通过合成纳米抗体筛选平台结合分子动力学模拟评估，研究人员筛选出一种能够高效结合并阻断CD300LD-PS相互作用的中和抗体，命名为CD300LD.L14（小鼠源）。 * 临床前疗效评估： * 单药治疗： CD300LD.L14单药在多种小鼠肿瘤模型（B16-F10, TC-1, Renca, HCC）中均显示出显著的抗肿瘤效果，能抑制肿瘤生长、延长生存期，并重塑肿瘤免疫微环境（减少PMN-MDSC，增加CD8+ T细胞和PS-high CD8+ T细胞）。在部分Renca荷瘤小鼠中甚至诱导了完全缓解和长期的免疫记忆。 * 联合治疗： CD300LD.L14与抗PD-1抗体联用，在B16-F10和MC38模型中表现出强大的协同效应。在MC38模型中，联合治疗使60%（9/15）的小鼠达到完全缓解，并且治愈的小鼠能够抵抗肿瘤的再次攻击。 * 靶点的人源化验证与临床相关性： * 功能保守性： 证实人源CD300LD同样结合PS，且其关键结合残基（D115，对应小鼠D116）的功能保守。构建了人源CD300LD（hULD）及其PS结合缺陷突变体（D115A）的基因敲入小鼠，在模型中验证了PS结合对其促瘤功能的关键作用。 * 抗体优化： 对CD300LD.L14进行理性设计优化，获得了能有效结合并阻断人源CD300LD-PS相互作用的抗体变体CD300LD-L14-1，并在人源化小鼠模型中验证了其抗肿瘤活性。 * 临床数据分析： 分析癌症基因组图谱（TCGA）等公共数据库发现，在多种癌症中，CD300LD的表达与PS-high CD8+ T细胞特征基因表达呈负相关。在黑色素瘤患者中，高表达PS-high特征基因的患者通常预后更好，但这种生存获益在CD300LD高表达的亚组中消失。对接受ICB治疗的黑色素瘤患者队列数据分析显示，有临床应答的患者肿瘤中CD300LD表达更低而PS-high CD8特征更高。在结直肠癌患者外周血样本中也观察到，PMN-MDSCs上CD300LD的表达水平与循环中PS-high CD8+ T细胞的比例呈显著负相关。这些数据强烈支持CD300LD-PS轴在人类癌症免疫抑制和免疫治疗耐药中的关键作用。
第四， 主要研究结果 本研究取得了一系列系统性且逻辑连贯的结果：
这些结果层层递进：从分子识别（CD300LD结合PS），到细胞行为（介导PMN-MDSC与T细胞接触），再到功能后果（抑制T细胞功能、促进肿瘤生长），最终转化为治疗策略（开发中和抗体并验证疗效），构成了一个完整、闭环的研究故事。
第五， 研究结论与价值 本研究得出核心结论：CD300LD是PMN-MDSCs表面一个关键的PS受体，它通过直接结合活化CD8+ T细胞表面暴露的PS，介导两者间的物理接触，从而驱动PMN-MDSCs对细胞毒性T细胞实施接触依赖性的免疫抑制。阻断CD300LD-PS轴能有效破坏这一免疫抑制机制，逆转T细胞功能障碍，增强抗肿瘤免疫力。
其科学价值在于： 1. 机制创新： 首次阐明了PMN-MDSCs介导接触依赖性T细胞抑制的一个关键分子机制，填补了该领域长期存在的知识空白。 2. 概念突破： 将PS在肿瘤免疫中的作用从经典的“凋亡清除”信号，扩展到作为免疫细胞间功能性互作的调节分子，特别是定义了PS-high CD8+ T细胞这一功能状态及其被靶向抑制的命运。 3. 靶点发现： 鉴定出CD300LD是一个全新的、具有潜力的免疫检查点分子。其作用模式独特（结合脂质配体），且特异性表达于免疫抑制性的PMN-MDSCs上，可能带来更好的靶向特异性和安全性。
其应用价值在于： 1. 治疗新策略： 提供了通过靶向CD300LD-PS轴来解除PMN-MDSCs介导的免疫抑制、克服ICB耐药的新方法。开发的中和抗体展现出优异的临床前疗效。 2. 联合治疗潜力： 证明了靶向CD300LD与现有PD-1/PD-L1抑制剂具有强大的协同作用，为设计新一代联合免疫治疗方案提供了依据。 3. 生物标志物： CD300LD的表达以及PS-high CD8+ T细胞的特征可能作为预测ICB疗效和患者分层的新型生物标志物。
第六， 研究亮点 1. 关键机制发现： 清晰阐明了CD300LD-PS作为介导PMN-MDSC与CD8+ T细胞免疫突触形成的分子对，是领域内的重要突破。 2. 技术创新： 自主研发并应用了基于细菌分选酶A的邻近标记技术，实现了在复杂生理环境下对免疫细胞间瞬时、特异性相互作用的动态示踪，方法具有创新性。 3. 研究系统性与严谨性： 从计算模拟、生化验证、细胞互作、动物模型到临床数据分析，研究设计全面，使用了基因敲除、点突变敲入、人源化模型、多种肿瘤模型等多重手段进行交叉验证，结论可靠。 4. 强大的转化前景： 不仅揭示了基础机制，还同步完成了治疗性抗体的开发、优化及临床前疗效验证，并提供了初步的人类疾病相关性证据，体现了从“基础到临床”的完整转化研究思路。
第七， 其他有价值内容 本研究还提示了未来研究方向：CD300LD可能识别除PS之外的其他配体