本文介绍了一项发表于《Analytical Chemistry》2021年第93卷第12447-12455页的研究，作者为Wen-Kai Fang, Liu Liu, Li-Ling Zhang, Da Liu, Yang Liu和Hong-Wu Tang*，均来自武汉大学化学与分子科学学院。该研究属于分析化学与生物传感交叉领域，旨在开发一种高灵敏度、高特异性的早期阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）检测新方法。AD作为一种进展性神经退行性疾病，严重危害老年人群健康，其早期诊断对于延缓病程和及时治疗至关重要。研究表明，β-淀粉样蛋白寡聚体（Amyloid β oligomers, AβOs）是AD的关键生物标志物和最具有毒性的物种，在临床症状出现前即可诱导突触功能障碍和神经元凋亡。因此，开发能够准确定量AβOs的检测技术具有重要临床意义。目前，尽管存在多种AβOs检测方法，但传统的有机荧光探针存在光稳定性差、浓度猝灭和信背比低等问题。本研究旨在通过集成光学镊子（Optical Tweezer, OT）技术与高掺杂上转换纳米颗粒（highly doped upconversion nanoparticles, H-UCNPs），构建一种新型的比率荧光检测平台，以实现对AβOs的高性能检测。
本研究的工作流程复杂且精细，主要分为以下几个关键步骤：首先是高性能探针的合成与构建，其次是检测平台的搭建，最后是特异性定量检测实验与数据分析。探针的合成始于高掺杂核-壳-壳结构上转换纳米颗粒（NaYF4@NaYF4: 0.2 Yb3+, 0.2 Er3+@NaYF4, H-UCNPs）的制备。研究人员采用经典的热分解法，先合成NaYF4纳米颗粒作为内核，然后在其外依次生长包含高浓度Er3+（20%）和Yb3+（20%）的活性层以及一层惰性NaYF4外壳，以增强上转换发光（upconversion luminescence, UCL）并抑制表面能量淬灭。通过透射电子显微镜（TEM）和X射线衍射（XRD）等手段，确认了所合成H-UCNPs的均一形貌（直径约43纳米）和高结晶度。随后，通过配体交换将油酸（Oleic Acid, OA）配体替换为聚丙烯酸（Poly(acrylic acid), PAA），使H-UCNPs具备水溶性和进一步修饰的羧基官能团。接下来，通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）介导的酰胺化反应，将H-UCNPs-PAA共价连接到1微米的氨基二氧化硅（NH2-SiO2）微球表面，形成H-UCNPs-SiO2复合微球。扫描电子显微镜（SEM）和TEM图像清晰地展示了H-UCNPs在微球表面的均匀附着。
探针功能化的核心步骤是在H-UCNPs-SiO2微球表面生长金属有机框架（Metal-Organic Framework, MOF）ZIF-8层并封装淬灭剂分子。研究人员首先用聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone, PVP）修饰H-UCNPs-SiO2，然后在其表面原位生长ZIF-8，形成H-UCNPs-SiO2@ZIF-8（简称H-USM）微球。TEM和SEM显示形成了厚度约为15纳米的致密ZIF-8涂层。zeta电位测量显示微球表面电荷从负值变为正值，进一步证实了带正电的ZIF-8的成功包覆。随后，将一种高效的暗淬灭剂黑孔猝灭剂-1（Black Hole Quencher-1, BHQ-1）分子负载到ZIF-8的孔道中，形成最终的探针H-USM/BHQ-1。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和紫外-可见光谱（UV-Vis）分析证实了BHQ-1的成功封装。关键的是，BHQ-1的吸收光谱与H-UCNPs在525和540纳米处的绿色发射光谱高度重叠，为实现高效的发光共振能量转移（Luminescence Resonance Energy Transfer, LRET）提供了基础。光谱测试表明，封装BHQ-1后，H-UCNPs的540纳米绿色发射（UCL540）被显著淬灭，而654纳米的红色发射（UCL654）保持不变，LRET效率高达89.58%。
研究中的另一项关键技术是自主搭建的光学镊子显微成像系统。该系统以980纳米连续激光作为光源，既用于光镊捕获单个H-USM/BHQ-1微球，也用于激发UCL。激光束经过扩束和4f系统后被高数值孔径（NA=1.45）的100倍物镜高度聚焦，形成直径约0.56微米的光阱。计算表明，即使激光器输出功率不高，在光阱中心也能产生高达~10^7 W/cm^2的功率密度。这种高功率密度能有效激发H-UCNPs产生强上转换发光，同时光镊技术固定单个微球，避免了流体粘度等环境干扰，显著提升了检测的信噪比和灵敏度。为了验证高掺杂的优势，研究对比了高掺杂（20% Er3+）与低掺杂（2% Er3+）UCNPs的发光性能。在相同激发光功率下，H-UCNPs的发光强度显著高于低掺杂UCNPs。更重要的是，在光镊激发下，随着激光功率增加，H-UCNPs的发光增强效应（功率依赖性）远优于低掺杂颗粒，当激光功率密度超过0.8 W/cm2时，其654纳米发射强度是低掺杂颗粒的8倍。这得益于高功率密度克服了Yb3+激发态饱和的问题，并且光镊的局域激发有效抑制了高浓度掺杂引起的能量迁移和交叉弛豫能量损失。此外，即使在5分钟的持续光镊捕获下，H-UCNPs的发光也表现出了优异的稳定性。
在完成探针构建和平台搭建后，研究团队进行了AβOs的定量检测。检测原理基于竞争性配位作用：ZIF-8中的Zn2+离子能够被AβOs肽链上的组氨酸（His）、谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）等氨基酸特异性识别和结合。当体系中存在AβOs时，AβOs会竞争性结合Zn2+，导致ZIF-8结构解离，包埋在其中的BHQ-1分子被释放。这使得原本被高效淬灭的540纳米绿色发射（UCL540）得以恢复，而作为内参信号的654纳米红色发射（UCL654）保持不变。因此，UCL540/UCL654的强度比值与AβOs的浓度正相关。实验时，将不同浓度（100 pM 至 10 μM）的AβOs溶液与H-USM/BHQ-1探针微球混合反应，洗涤后，用光镊随机捕获50个微球，分别记录其UCL540和UCL654的荧光图像，并通过ImageJ软件分析荧光强度比值。
研究取得了显著的结果。首先，荧光成像图直观显示，随着AβOs浓度的增加，微球的绿色荧光逐渐恢复，而红色荧光保持恒定。其次，定量分析表明，UCL540/UCL654的强度比值与AβOs浓度的对数值在100 pM至10 μM范围内呈现良好的线性关系，相关系数（R²）为0.991。根据3σ准则计算出的检测限（Limit of Detection, LOD）低至28.4 pM，表明该方法具有极高的灵敏度。与文献中其他AβOs检测方法相比（如酶联免疫吸附法、电化学法），此方法的灵敏度具有竞争力。为了评估该策略的特异性，研究测试了其对Aβ单体（AβMs）、Aβ纤维（AβFs）以及其他三种常见蛋白质（癌胚抗原CEA、甲胎蛋白AFP和牛血清白蛋白BSA）的响应。结果表明，仅有AβOs能引起UCL540/UCL654比值的显著升高，而其他干扰物质，包括具有相似氨基酸序列但聚集状态不同的AβMs和AβFs，均未产生明显干扰。这归因于AβMs浓度较低不足以解离ZIF-8，而AβFs因其聚集结构可能隐藏了与Zn2+结合的氨基酸位点，从而表现出较低的反应性。该结果证明了该方法对AβOs具有优异的选择性，有望应用于复杂的生物体液样本检测。
本研究的结论是，成功构建了一种结合高掺杂上转换纳米颗粒-SiO2@金属有机框架/黑孔淬灭剂微球（H-USM/BHQ-1）与光学镊子显微成像的比率荧光检测新策略，用于AD生物标志物AβOs的高灵敏、高特异性检测。该策略的科学价值和应用价值体现在多个方面。在科学层面，它创造性地将光镊技术与高掺杂UCNPs的优势相结合：光镊不仅提供了捕获和操控单颗粒的能力以排除环境干扰，其产生的高功率密度激光更是有效激发了高掺杂UCNPs的强上转换发光，克服了传统溶液中低功率激发下高掺杂UCNPs易发生浓度淬灭的难题，为新型高性能光学探针的设计提供了新思路。此外，利用ZIF-8框架封装淬灭剂并实现AβOs触发的特异性结构解离，构建了新颖的“Turn-on”型传感机制。在应用层面，该方法实现了对AβOs的皮摩尔级（pM）检测，灵敏度高，且具有优异的抗干扰能力，为AD的早期无创诊断和病程监测提供了一种极具潜力的新型工具。
本研究的亮点主要包括：第一，方法学的创新性：首次将光学镊子单颗粒操控技术与高掺杂上转换纳米颗粒的比率荧光传感相结合，实现了在单颗粒水平上对生物标志物的高灵敏、高信背比检测。第二，探针设计的精巧性：构建了集信号放大（H-UCNPs）、特异性识别（ZIF-8与AβOs的竞争性配位）、高效淬灭（BHQ-1）和内置校准（UCL654内参）于一体的多功能复合微球探针。第三，性能卓越：实现了高达89.58%的LRET效率，获得了低至28.4 pM的检测限，并对AβOs展现出高度特异性，这些性能指标在同类研究中表现突出。第四，揭示了高掺杂UCNPs在光镊激发下的优势：通过对比实验，明确证实了在光镊提供的高功率密度激发下，高掺杂UCNPs相较于低掺杂颗粒在发光强度和功率依赖性方面的显著优势，为后续研究提供了重要参考。