学术报告：哇巴因对巴西寨卡病毒株的抗病毒活性研究

主要作者及研究机构

本研究由Deyse Cristina Madruga Carvalho、Poliana Gomes da Silva、Willyenne Marília Dantas等学者共同完成。第一作者Deyse Cristina Madruga Carvalho隶属于巴西帕拉伊巴联邦大学生物技术中心免疫生物技术实验室（Laboratory of Immunobiotechnology, Biotechnology Center, Federal University of Paraíba）以及奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会阿格乌·马加良斯研究所病毒学与实验治疗部（Department of Virology and Experimental Therapy, Aggeu Magalhães Institute, Oswaldo Cruz Foundation）。通讯作者为Sandra Rodrigues-Mascarenhas和Lindomar José Pena。该研究于2022年发表于*Scientific Reports*期刊，文章编号为12:12598。

研究背景

寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）于1947年在乌干达寨卡森林首次被分离，此后虽有人类感染病例报告，但直到2015至2016年在巴西暴发大规模疫情，该病毒才引起全球关注。当时首次报道了寨卡病毒感染与新生儿小头畸形之间的关联，随后又发现该病毒与成人吉兰-巴雷综合征（Guillain–Barré syndrome）以及先天性寨卡综合征（Congenital Zika Syndrome, CZS）等严重神经系统疾病相关。目前全球已有87个国家报告寨卡病毒传播，然而至今仍无特异性疫苗或抗病毒药物可用于治疗寨卡病毒感染，因此开发安全有效的抗寨卡病毒药物具有紧迫性。

哇巴因（ouabain）是一种强心类固醇（cardiotonic steroid），经典上被认为通过抑制钠钾ATP酶（Na⁺/K⁺-ATPase）发挥作用。此前已有研究表明哇巴因对多种DNA和RNA病毒具有抗病毒活性，且纳摩尔浓度即可生效。此外，本研究团队此前曾报道哇巴因具有免疫调节及抗炎活性。基于上述背景，本研究旨在首次评估哇巴因对一株巴西寨卡病毒株的体外（in vitro）和计算机模拟（in silico）抗病毒活性。

研究的详细工作流程

本研究分为体外实验和理论计算两大模块。

（一）体外实验部分

研究所用的病毒株为巴西寨卡病毒株ZIKV/H.sapiens/Brazil/PE243/2015（简称ZIKV PE243），该毒株于2015年巴西疫情期间从一名典型寨卡出疹性疾病患者体内分离获得，GenBank登录号为KX197192.1。实验细胞为Vero细胞，使用DMEM培养基并添加10%胎牛血清等成分进行培养。病毒通过组织培养半数感染剂量（TCID₅₀）方法在Vero细胞上扩增和滴定，以细胞病变效应（cytopathic effect, CPE）为读数。

首先进行了细胞毒性实验。研究者使用MTT法和CPE评分法评估哇巴因对Vero细胞的毒性。细胞以1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，培养24小时后加入浓度范围为0.001至500 μM的哇巴因，继续孵育120小时。通过倒置显微镜观察CPE并进行评分，评分标准为：CPE<25%记1分，25%–50%记2分，51%–75%记3分，>75%记4分。随后加入MTT溶液（1 mg/mL）孵育4小时，用DMSO溶解甲臜结晶，在540 nm波长下测定吸光度。结果显示CC₂₀（20%细胞毒性浓度）为20 nM，CC₅₀（50%细胞毒性浓度）为68.9 nM。20 nM被定义为抗病毒筛选的最大无毒浓度。

接着进行了抗病毒活性评估，分为预处理（pre-treatment）和后处理（post-treatment）两种方式。Vero细胞以2.5×10⁴个/孔接种于48孔板，培养一天后，分别在感染前或感染后（感染复数MOI=0.1，感染1小时后）加入哇巴因，浓度梯度为2.5、5、10和20 nM。以6-甲基巯基嘌呤核苷（6MMPR，60.5 μM）作为阳性对照，该药物由研究团队此前鉴定为有效的寨卡病毒抑制剂。感染120小时后观察CPE并收集上清液用于病毒滴定。通过TCID₅₀方法测定病毒滴度，并计算IC₅₀（半数抑制浓度）。在预处理组中哇巴因的IC₅₀为2.33 nM，在后处理组中为1.92 nM，选择性指数（SI=CC₅₀/IC₅₀）分别为29.5和35.8，说明哇巴因的抗病毒效果并非由细胞毒性引起。

为了进一步从RNA水平验证哇巴因的作用，研究采用RT-qPCR定量病毒RNA拷贝数。使用QIAamp病毒RNA提取试剂盒从上清中提取总RNA，用Quantinova Probe RT-PCR试剂盒在QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪上进行检测。所用引物和探针序列针对寨卡病毒基因组特定区域设计，FAM标记探针等反应体系总体积为10 μL。通过将Cq值与预先构建的体外转录RNA标准曲线比对，计算每份样品中的RNA拷贝数。标准曲线RNA的制备方法是：在正向引物5′端添加T7启动子序列，从cDNA扩增目标片段后用MEGAscript T7转录试剂盒进行体外转录，经Nanodrop定量后计算拷贝数。

为明确哇巴因是否干扰病毒生命周期的早期步骤，研究者设计了三组实验。第一组为病毒灭活实验：将病毒悬液（MOI=0.1）与等体积不同浓度哇巴因在37°C孵育1小时，然后进行病毒滴定，以判断哇巴因是否具有直接杀病毒活性。第二组为抗吸附实验：Vero细胞在4°C条件下（允许病毒结合但阻止进入）与ZIKV和不同浓度哇巴因共同孵育1小时，之后用PBS洗涤两次，加入DMEM继续培养，120小时后进行病毒滴定。第三组为病毒内化抑制实验：先将细胞与病毒在4°C孵育1小时使病毒附着，用PBS去除未吸附病毒后，将细胞在37°C下（促进病毒进入）与不同浓度哇巴因孵育1小时；之后用柠檬酸缓冲液（pH 3）处理1分钟以灭活已吸附但未内化的病毒，最后加入DMEM培养120小时后滴定病毒。

（二）理论计算部分

理论计算旨在预测哇巴因与寨卡病毒非结构蛋白之间的结合亲和力。研究对象包括三个主要的药物靶标蛋白：NS3解旋酶（NS3-helicase）、NS5甲基转移酶（NS5-methyltransferase, NS5-MTase）和NS5 RNA依赖性RNA聚合酶（NS5 RNA-dependent RNA polymerase, NS5-RdRp）。研究者从蛋白质数据库（PDB）下载了与小分子共结晶的X射线结构，其中NS3-helicase选择了分辨率较高的5RHQ结构，NS5-MTase和NS5-RdRp分别采用5WZ2和5WZ3结构。通过PyMOL进行结构比对，计算共结晶配体的质心以确定结合口袋位置；对NS3-helicase的多个结构进行骨架RMSD分析以确认构象一致性。使用Modeller软件补齐缺失残基，并通过PDB2PQR软件在pH 7.4条件下预测残基质子化状态。哇巴因的三维结构从PDB条目3A3Y中提取，使用OpenBabel转换为mol2格式并分配Gasteiger电荷。

分子对接使用GOLD软件（版本5.8.1）的遗传算法（Genetic Algorithm, GA）进行，以共结晶配体的质心平均坐标作为结合位点，设定12 Å的活性残基截断半径。对接结果显示，在NS3-helicase中共鉴定出10个可成药结合位点，NS5-MTase和NS5-RdRp各2个。哇巴因在NS5-MTase结合位点1的对接得分最高（27.09），在NS3-helicase结合位点7的得分为24.04；但在NS5-RdRp的结合位点0中，GOLD未能生成哇巴因的结合构象，可能由于该区域存在空间位阻。

对接后的复合物经过分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟进行构象优化和结合亲和力重评分。蛋白质使用ff14SB力场参数化，哇巴因使用GAFF力场，部分电荷通过AM1-BCC方法计算。复合物被置于20 Å的TIP3P水盒子中，并加入0.15 M NaCl。使用NAMD软件（版本2.13）进行模拟，采用周期性边界条件、SHAKE算法约束含氢键振动、2 fs时间步长、12 Å静电截断以及PME方法处理长程静电。体系依次经历能量最小化、从0 K升温至310 K、加压、然后在NPT系综下平衡10 ns，每5 ps保存一帧轨迹。轨迹分析使用cpptraj软件。RMSD分析显示，NS3-helicase、NS5-MTase和NS5-RdRp的骨架在模拟过程中未发生显著构象变化，哇巴因在多数结合位点中最后5 ns内达到构象稳定。

结合自由能计算采用MM/PBSA方法，利用平衡模拟最后2 ns中的21帧进行计算，参数根据Wang等人的研究进行设置（包括现代非极性溶剂模型、0.50 Å网格间距、内部介电常数4等）。结果显示哇巴因在NS5-RdRp结合位点1的计算结合自由能（ΔG_bind）为−10.58 kcal/mol，在NS3-helicase结合位点5为−9.48 kcal/mol，表明两者具有高亲和力。同时使用PM7半经验量子化学方法在MOPAC软件中计算结合焓（ΔH_bind），采用MOZYME线性标度算法、COSMO隐式溶剂模型（相对介电常数78.4）等，得到的焓值分别为−121.76 kcal/mol和−117.30 kcal/mol。MM/PBSA结果与半经验量子计算结果的Pearson相关系数r²为0.77。

氢键分析表明，在NS3-helicase结合位点5中，Leu507的主链氧原子和氮原子以及Ala517的主链氧原子与哇巴因形成氢键；以出现频率大于30%作为“热点”标准，Glu231和Asn417是与哇巴因形成稳定氢键的关键残基。在NS5-RdRp结构域中，Glu460、Ser663、Asp665和Ser712与哇巴因形成强氢键，其中Glu186最为重要。相比之下，NS5-MTase结构域在模拟过程中未与哇巴因形成强氢键。

主要研究结果

哇巴因的细胞毒性与抗病毒活性。 哇巴因对Vero细胞的CC₂₀和CC₅₀分别为20 nM和68.9 nM，均在纳摩尔范围。病毒滴定结果显示，哇巴因在预处理和后处理条件下均能剂量依赖性地降低感染性病毒滴度。在预处理实验中，2.5、5、10和20 nM哇巴因分别使病毒滴度降低61.2%、81.8%、89.7%和98%；在后处理实验中，同样浓度梯度下的病毒滴度降低幅度分别为93.7%、96.3%、99%和99.3%。后处理实验中最高浓度（20 nM）使病毒滴度降低2.2个log₁₀单位，与阳性对照6MMPR的降低幅度（2.5 log₁₀，99.7%）相近。此外，20 nM哇巴因还能阻止与感染进展相关的细胞形态学改变（细胞皱缩和聚集），即寨卡病毒CPE的出现。

哇巴因对病毒RNA水平的影响。 RT-qPCR结果显示，预处理组的哇巴因未能显著降低病毒RNA拷贝数；但在后处理组中，2.5、5、10和20 nM哇巴因分别使病毒RNA水平降低65.6%、71.9%、71.3%和78.1%。这一模式与病毒滴度实验结果一致，表明哇巴因主要作用于感染后阶段而非感染前阶段，且可能通过抑制病毒基因组复制来降低RNA水平。

哇巴因不影响病毒生命周期的早期步骤。 时间依赖性添加实验的结果显示，将病毒与所有测试浓度的哇巴因在37°C预先孵育1小时对病毒滴度无影响，说明哇巴因不具有直接杀病毒活性。在抗吸附实验中，不同浓度哇巴因处理组与对照组的病毒滴度无显著差异，表明哇巴因不阻断病毒吸附到宿主细胞表面。同样，在病毒内化抑制实验中，哇巴因也未影响病毒的内化过程。这些结果共同表明哇巴因不干扰寨卡病毒进入细胞的早期阶段，其抗病毒作用可能发生在病毒的复制阶段。

哇巴因与寨卡病毒非结构蛋白的结合。 分子动力学模拟和MM/PBSA分析表明，哇巴因在NS5-RdRp结合位点1处具有最高的结合亲和力（ΔG_bind = −10.58 kcal/mol），在NS3-helicase结合位点5处次之（ΔG_bind = −9.48 kcal/mol）。在NS3-helicase中，哇巴因结合于靠近ATP水解相关环区（P-loop）和RNA结合结构域的位置，并与Asn417残基形成稳定氢键；而以往研究曾报道儿茶素没食子酸酯（EGCG）通过与同一残基Asn417形成氢键而抑制NS3-helicase的NTPase活性。在NS5-RdRp中，哇巴因结合于靠近酶活性位点的区域，与Glu460、Asp665和Asp666等保守残基相互作用。已知Asp535、Asp665和Asp666是黄病毒RdRp活性位点中高度保守的残基，在RNA链聚合中起重要作用。因此，哇巴因可能通过变构效应抑制NS3-helicase和NS5-RdRp的活性，从而阻断病毒RNA的复制过程。

结论

本研究首次证实了哇巴因对一株巴西寨卡病毒株（ZIKV PE243）具有体外抗病毒活性。哇巴因在纳摩尔浓度下即可有效降低感染性病毒滴度和病毒RNA拷贝数，且主要在感染后给药时发挥作用。机制研究表明，哇巴因不影响病毒的吸附、内化或直接灭活病毒，提示其作用靶点位于病毒生命周期的复制阶段。计算机模拟数据表明，哇巴因可以与寨卡病毒NS3-helicase和NS5-RdRp的关键位点稳定结合，结合自由能为负值且具有构象稳定性，这可能是其抑制病毒复制的分子机制之一。总体而言，该研究证明了强心类固醇作为抗病毒药物的潜力，并为哇巴因作为寨卡病毒感染的候选治疗药物提供了实验依据。

研究亮点

第一，本研究是首次评估哇巴因对巴西寨卡病毒株（ZIKV PE243）的抗病毒活性，该毒株为2015–2016年巴西疫情的流行株，与新生儿小头畸形等严重神经系统疾病密切相关。第二，本研究发现哇巴因的有效抗病毒浓度比此前Guo等人报道的低约50倍，提示不同地理来源的寨卡病毒株对哇巴因的敏感性可能存在差异，同时也说明巴西株可能对哇巴因更为敏感。第三，研究采用了时间依赖性添加实验系统地排除了哇巴因作用于病毒进入阶段的可能性，将作用阶段锁定在复制环节，并结合分子动力学模拟揭示了哇巴因与NS3-helicase和NS5-RdRp的潜在结合模式，为理解其抗病毒机制提供了新见解。第四，本研究利用计算机模拟提示哇巴因可能不仅通过经典的Na⁺/K⁺-ATPase途径发挥作用，还可能直接作用于病毒复制相关蛋白，为强心类固醇的抗病毒机制提供了新的理论假说。