一、主要研究者、机构及发表信息 本研究的通讯作者是Anna Schurich，其所属及主要合作机构包括：英国伦敦大学学院（University College London）感染与免疫学部、伦敦玛丽女王大学（Queen Mary University of London）巴茨和伦敦医学与牙科学院、伦敦大学学院医院（University College London Hospital）以及英国剑桥大学MRC癌症研究所等。研究论文于2016年8月2日发表于《Cell Reports》期刊，标题为 “Distinct metabolic requirements of exhausted and functional virus-specific CD8 T cells in the same host”。

二、研究背景与目的 本研究属于免疫代谢学领域，旨在探索慢性病毒感染背景下，抗原特异性CD8 T细胞的功能状态与其代谢特征之间的内在联系。CD8 T细胞在激活后会发生深刻的代谢重编程，通常从依赖氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OXPHOS）转向糖酵解（Glycolysis）以快速满足增殖和效应功能的能量需求。然而，这种代谢适应在控制不同慢性病毒感染的CD8 T细胞中是否存在差异，以及代谢特征是否塑造了其效应功能，尚不完全清楚。

研究团队选择了两个典型的模型：功能耗竭的乙型肝炎病毒（HBV）特异性CD8 T细胞和功能良好的巨细胞病毒（CMV）特异性CD8 T细胞。这两种细胞都存在于同一宿主体内，针对的是同为持续性的病毒感染，但临床结局截然不同。HBV感染无法被清除，其特异性T细胞功能耗竭，表现为表达高水平的抑制性受体（如PD-1），效应功能（如产生IFN-γ）低下。相反，CMV特异性T细胞能够有效控制病毒，功能强大，易于检测且扩增良好。因此，本研究旨在比较这两类病毒特异性CD8 T细胞的代谢需求、限制以及其与效应功能之间的关联，核心目标是阐明代谢表型如何决定抗病毒T细胞反应的效能。

三、详细研究流程与方法 本研究采用了多步骤、多层次的实验方法，从患者样本获取到体外功能与代谢分析，具体流程如下：

1. 研究对象与样本采集： 研究对象为慢性HBV感染者（均为HIV和HCV阴性且未接受过抗病毒治疗）。研究使用了这些患者的两种样本：外周血单个核细胞（PBMCs）和（部分患者的）肝组织活检样本以获取肝内淋巴细胞（IHLs）。这确保了可以同时研究同一患者体内的HBV和CMV特异性CD8 T细胞，并进行配对比较。患者的人类白细胞抗原（HLA）分型被用于匹配特异性肽段或四聚体（Dextramer）进行细胞识别。

2. 实验流程概览： 研究主要分为以下几个关键环节：体外细胞培养与刺激、细胞表型与功能分析、代谢特征评估以及白介素-12（IL-12）的干预研究。

• 步骤一：病毒特异性T细胞的体外扩增与激活。 从患者PBMCs中分离细胞，使用HBV或CMV的特异性肽段进行刺激，并加入白细胞介素-2（IL-2）支持细胞生长，培养9天。在某些实验中，在初始刺激时加入IL-12以观察其影响。
• 步骤二：代谢相关蛋白表达分析（重点：Glut1）。 研究首先通过流式细胞术分析了葡萄糖转运蛋白1（Glut1）的表达。分别在以下情况检测：① 直接离体分析：PBMCs或肝内淋巴细胞经4小时肽段刺激后，使用HLA-A2限制性肽段-四聚体直接染色识别HBV或CMV特异性CD8 T细胞，并检测Glut1表达。② 体外培养后分析：经过9天培养的细胞，在重新用肽段刺激时，通过检测细胞内干扰素-γ（IFN-γ）的产生来识别病毒特异性细胞，并同时检测其表面的Glut1表达。此外，还使用了荧光葡萄糖类似物2-NBDG来验证Glut1高表达是否确实导致了更高的葡萄糖摄取。
• 步骤三：模拟肝内环境（缺氧）的影响。 为了探究HBV特异性T细胞所处的肝内低氧环境是否影响其代谢表型，研究团队在细胞再刺激阶段（第9-10天）将细胞置于低氧（5% O2，模拟肝内氧浓度）或常氧（21% O2）条件下培养，然后比较HBV和CMV特异性T细胞Glut1表达的变化。
• 步骤四：糖酵解依赖性与线粒体功能评估。 这是本研究的核心代谢功能实验。经过扩增的T细胞在再刺激前24小时，被转移至两种不同的培养基中：一种是含有10 mM葡萄糖的正常培养基，另一种是含有10 mM半乳糖（Galactose）的培养基。半乳糖不能有效地被糖酵解途径利用，因此细胞被迫更多地依赖线粒体OXPHOS来产生能量。随后，细胞被重新用肽段刺激，并通过流式细胞术分析IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生，以此评估在糖酵解受限时，细胞维持效应功能的能力。同时，使用线粒体膜电位依赖性染料JC-1和线粒体质量（质量）染料MitoTracker Green，通过流式细胞术分别评估了HBV和CMV特异性T细胞的线粒体膜电位和线粒体大小/质量。
• 步骤五：线粒体呼吸功能分析（Seahorse分析）。 由于循环中HBV特异性T细胞数量极少，无法直接分离进行生化分析，研究转而分析了与耗竭相关的PD-1+ CD8 T细胞的整体代谢特征。从患者PBMCs中分选出PD-1+ 和 PD-1- 的CD8 T细胞，使用Seahorse XF-24细胞外通量分析仪实时测量其耗氧率（OCR，反映OXPHOS）和细胞外酸化率（ECAR，反映糖酵解）。通过依次加入线粒体抑制剂寡霉素（Oligomycin，抑制ATP合酶）、FCCP（解偶联剂，使线粒体呼吸达到最大能力）和鱼藤酮/抗霉素A（Rotenone/Antimycin A，完全抑制线粒体呼吸），计算了细胞的备用呼吸容量（Spare Respiratory Capacity， SRC），即细胞应对额外能量需求的最大呼吸潜力。
• 步骤六：IL-12对代谢和功能的挽救作用研究。 基于团队先前发现IL-12可以恢复耗竭HBV特异性T细胞的效应功能，本研究进一步探讨了IL-12是否通过改变代谢来实现这一作用。在初始培养阶段加入IL-12，然后在再刺激时比较细胞在半乳糖和葡萄糖培养基中的IFN-γ产生能力，并检测IL-12处理后HBV特异性T细胞线粒体膜电位的变化。

3. 数据分析方法： 研究主要使用流式细胞术数据进行统计分析，数据以中位数和范围表示。组间比较采用非参数曼-惠特尼U检验（Mann-Whitney test），配对样本比较采用威尔科克森符号秩检验（Wilcoxon matched-pairs test）。显著性水平以星号标示（*p < 0.05; **p < 0.005; ***p < 0.0005）。

四、主要研究结果 1. HBV特异性CD8 T细胞高表达葡萄糖转运蛋白Glut1： 无论是直接离体分析还是体外培养后分析，来自同一患者的HBV特异性CD8 T细胞（无论通过四聚体还是IFN-γ产生来识别）的Glut1表达水平均显著高于功能良好的CMV特异性CD8 T细胞。使用2-NBDG证实，这种高Glut1表达确实伴随着更高的葡萄糖摄取。这一发现起初令人费解，因为通常认为功能强大的效应T细胞才需要高糖酵解。 2. Glut1高表达与耗竭表型及肝内环境相关： 研究发现，来自肝内的CD8 T细胞（包括一个可检测到的HBV特异性细胞）比外周血中的同类细胞表达更多的Glut1。体外模拟肝内低氧环境（5% O2）能诱导CD8 T细胞Glut1表达上调，且与增殖无关。此外，在HBV特异性T细胞中，Glut1的表达水平与抑制性受体PD-1的表达呈正相关，并且与T细胞在体外的扩增幅度呈负相关（即反应最弱、最耗竭的细胞Glut1最高）。这些结果表明，Glut1的上调可能与T细胞在免疫抑制性、低氧的肝内环境中遭遇高剂量抗原所诱导的耗竭状态有关。 3. HBV特异性T细胞严重依赖糖酵解，而CMV特异性T细胞能灵活利用OXPHOS： 关键代谢功能实验显示，当细胞在半乳糖培养基中被剥夺有效的糖酵解途径时，HBV特异性CD8 T细胞产生IFN-γ和TNF-α的能力急剧下降甚至完全丧失。相反，许多CMV特异性CD8 T细胞的细胞因子产生几乎不受影响，甚至有所增加，另一些虽有下降但仍保留相当功能。这表明功能良好的CMV特异性T细胞能够利用OXPHOS来补充甚至替代糖酵解，以满足效应功能的能量需求，而耗竭的HBV特异性T细胞则完全依赖糖酵解，缺乏这种“代谢可塑性”。 4. HBV特异性T细胞存在线粒体缺陷： 为了解释上述代谢依赖性的差异，研究检测了线粒体状态。结果显示，HBV特异性CD8 T细胞比CMV特异性细胞拥有更大的线粒体质量，同时其线粒体膜电位显著降低（表现为JC-1染料红/绿荧光比下降），提示线粒体功能失调和去极化。这种线粒体缺陷并非由细胞凋亡引起（细胞活性正常），而是限制了HBV特异性T细胞转向OXPHos的能力。 5. 与耗竭相关的PD-1+ CD8 T细胞备用呼吸容量降低： Seahorse分析表明，从患者体内分选出的PD-1+ CD8 T细胞，其备用呼吸容量（SRC）显著低于PD-1-的CD8 T细胞。这意味着PD-1+细胞在面临能量需求增加时，其线粒体提供额外ATP的能力有限，与其耗竭表型和较差的代谢适应性相符。 6. IL-12能改善HBV特异性T细胞的代谢和功能： 研究证实，IL-12不仅能增强HBV特异性T细胞在葡萄糖培养基中的效应功能，更重要的是，它也能恢复这些细胞在半乳糖培养基（即糖酵解受限条件下）产生IFN-γ的能力。同时，IL-12处理显著提高了HBV特异性T细胞中线粒体极化（功能正常）的比例。这表明IL-12恢复效应功能的作用至少部分是通过改善线粒体功能和降低对糖酵解的绝对依赖来实现的。

五、研究结论与价值 本研究得出核心结论：在同一个宿主体内，针对不同持续性病毒的功能状态迥异的CD8 T细胞，具有截然不同的代谢表型。功能耗竭的HBV特异性CD8 T细胞表现出以Glut1高表达、绝对依赖糖酵解、线粒体功能失调和代谢可塑性丧失为特征的代谢缺陷。而功能良好的CMV特异性CD8 T细胞则能灵活运用糖酵解和OXPHOS两种途径，从而支持其强大的效应功能。

其科学价值在于：首次在人类慢性病毒感染模型中，直接在同一患者体内对比并建立了CD8 T细胞功能耗竭与特定代谢缺陷（线粒体功能障碍和OXPHOS利用受损）之间的因果关系。它揭示了“代谢检查点”是T细胞耗竭的一个内在特征，而不仅仅是激活后能量需求增加的结果。应用价值方面，研究提示针对代谢途径（例如，改善线粒体功能或打破对糖酵解的依赖）可能成为治疗慢性HBV感染、甚至其他由T细胞耗竭介导的疾病（如癌症、HIV感染）的新策略。研究还验证了IL-12通过改善T细胞代谢来恢复其功能的机制，为基于细胞因子的免疫治疗提供了理论依据。

六、研究亮点 1. 独特的比较模型： 利用同一慢性HBV感染者体内共存的、功能状态对立的HBV和CMV特异性CD8 T细胞进行配对比较，完美控制了遗传背景和整体免疫环境差异，使结果更具说服力。 2. 揭示了人类T细胞耗竭的代谢基础： 明确地将线粒体功能障碍和OXPHOS利用缺陷与人类病毒特异性CD8 T细胞的功能耗竭联系起来，超越了以往主要在鼠类模型中的发现。 3. 连接了组织微环境与细胞内在代谢： 通过低氧实验和肝内-外周血对比，将HBV特异性T细胞的代谢表型（Glut1高表达）与其活动的免疫抑制性肝内微环境联系起来，为耗竭表型的形成提供了环境解释。 4. 阐明了细胞因子恢复功能的代谢机制： 不仅证实了IL-12能恢复耗竭T细胞的功能，更进一步阐明了其部分作用机制是通过改善线粒体功能和增强代谢可塑性来实现的。 5. 多层次、严谨的实验设计： 从表型（Glut1, PD-1）到功能（细胞因子产生），从代谢灵活性（半乳糖实验）到线粒体状态（膜电位、质量）和呼吸功能（Seahorse），研究构建了完整的证据链，全面刻画了两种细胞的代谢肖像。

七、其他有价值的发现 研究还指出，PD-1信号本身可能与观察到的代谢变化有关，但同时也强调慢性HBV感染中T细胞还表达其他抑制性分子（如TIM-3, CTLA-4），因此代谢缺陷可能是多重抑制信号共同作用的结果。这提示未来研究需要深入剖析不同抑制性通路对T细胞代谢的具体影响。此外，研究提出一个前瞻性问题：其他慢性感染（如HCV、HIV）或肿瘤中的耗竭T细胞是否也存在类似的代谢缺陷，这将拓展代谢免疫治疗的应用范围。