关于177Lu标记的环状微胃泌素类似物在CCK2R表达肿瘤中治疗活性的临床前评估及配套药盒制剂开发的学术研究报告

一、 研究团队与发表信息 本研究由Christine Rangger、Maximilian Klingler、Elisabeth von Guggenberg（通讯作者）等人组成的跨国团队完成，成员分别来自奥地利因斯布鲁克医科大学核医学科（Department of Nuclear Medicine, Medical University of Innsbruck, Austria）、匈牙利布达佩斯OKK-Osski国家血液学与免疫学研究所核医学与转化生物科学部（Department of Nuclear Medicine and Translational Biological Sciences, OKK-Osski, Budapest, Hungary）以及波兰国家核研究中心Radioisotope Centre Polatom（Radioisotope Centre Polatom, National Centre for Nuclear Research, Otwock, Poland）。该研究成果以题为《177Lu labelled cyclic minigastrin analogues with therapeutic activity in cck2r expressing tumours, preclinical evaluation of a kit formulation》的论文形式，发表于学术期刊《Molecular Pharmaceutics》（Mol. Pharm.），最终编辑版本于2017年9月5日在线发布，卷期号为第14卷第9期，页码3045-3058。

二、 学术背景与研究目的 本研究属于核医学与肿瘤靶向治疗交叉领域，聚焦于肽受体放射性核素治疗（Peptide Receptor Radionuclide Therapy, PRRT）。其科学背景基于胆囊收缩素2型受体（Cholecystokinin-2 Receptor, CCK2R）在多种肿瘤（如甲状腺髓样癌、小细胞肺癌、星形细胞瘤、卵巢间质瘤等）中高表达的特性。因此，能够特异性靶向CCK2R的放射性标记肽段，为诊断和治疗这些肿瘤提供了新策略。

尽管早期基于人微胃泌素（Minigastrin, MG）的放射性药物（如111In-DTPA-MG0）在诊断中显示出潜力，但其用于治疗（如90Y-DTPA-MG0）时，因肾脏高摄取导致严重的肾毒性副作用。为克服此障碍，后续开发了截短型类似物MG11（缺失五谷氨酸序列），虽降低了肾脏摄取，但其血液半衰期过短，影响成像质量。因此，开发兼具高肿瘤靶向性、低非特异性组织摄取（尤其是肾脏）、良好体内稳定性的新型放射性治疗药物，成为该领域的关键需求。

基于此背景，本研究团队在前期工作中，以截短型MG11为基础，设计并合成了两种环状微胃泌素类似物：DOTA-cyclo-MG1和DOTA-cyclo-MG2。这两种肽段通过引入环状约束结构，旨在优化其药代动力学性质。本研究的主要目的包括：1) 为这两种环状类似物开发一种适用于临床的、冻干的配套药盒（kit）制剂，用于便捷、可重复地标记治疗性核素镥-177（177Lu）；2) 对药盒的储存稳定性及标记后放射性药物的稳定性进行全面评估；3) 在体外和体内模型中，系统评估177Lu标记的这两种环状类似物（177Lu-DOTA-cyclo-MG1 和 177Lu-DOTA-cyclo-MG2）的受体亲和力、细胞摄取、生物分布、治疗疗效及治疗毒性，为后续临床转化提供坚实的临床前数据。

三、 详细研究流程与方法 本研究包含一系列紧密衔接的实验流程，从分子、细胞到动物模型层层递进。

1. 体外表征与药盒开发： * 研究对象与样本： 研究核心是两种DOTA偶联的环状肽：DOTA-cyclo-MG1和DOTA-cyclo-MG2。作为对照，还合成了甲硫氨酸（Met）被氧化的DOTA-cyclo-Met(O)-MG1，以及一种正处于临床研究阶段的线性类似物CP04。细胞模型采用稳定转染人CCK2R的A431-CCK2R细胞系和不表达该受体的A431-mock对照细胞系。 * 实验方法与流程： * 受体结合实验： 在A431-CCK2R细胞上，使用125I标记的胃泌素-I作为放射配体，通过竞争性结合实验测定DOTA-cyclo-MG1、DOTA-cyclo-MG2及其与天然镥（natLu）络合后的半抑制浓度（IC50），评估其受体亲和力。同时测试了氧化产物DOTA-cyclo-Met(O)-MG1的亲和力，以验证甲硫氨酸氧化对活性的影响。 * 细胞摄取实验： 将上述肽段用177Lu标记后，与A431-CCK2R和A431-mock细胞共孵育2小时，分离并测量细胞内的放射性活度，计算内化分数，评估其受体介导的特异性摄取能力。 * 稳定性研究： 将标记好的177Lu-DOTA-cyclo-MG1和177Lu-DOTA-cyclo-MG2分别置于磷酸盐缓冲液（PBS，模拟制剂环境）和人血清（模拟体内酶解环境，37°C）中孵育长达24小时。通过高效液相色谱（HPLC）定期分析，评估其化学稳定性和对酶降解的稳定性，计算在血清中的半衰期。 * 药盒制剂开发与标记： 开发了冻干药盒配方，包含肽（50 µg）、抗坏血酸（稳定剂，25 mg）、L-甲硫氨酸（L-Met，防止氧化，5.2 mg）和龙胆酸（gentisic acid，防止辐射分解，0.53 mg）。标记时，仅需加入约2 GBq的177LuCl3溶液，80°C加热15-25分钟即可。系统评估了药盒在储存（长达6个月）以及标记产物在不同条件下（室温或-20°C）存放（长达48小时）后的放射化学纯度（Radiochemical Purity, RCP）。

2. 体内药代动力学与治疗研究： * 研究对象与样本： 使用5-6周龄的BALB/c裸鼠，在其双侧胁腹皮下接种A431-CCK2R（CCK2R阳性）和A431-mock（CCK2R阴性）细胞，建立双肿瘤异种移植模型。每组实验通常包含5只动物。 * 实验方法与流程： * 生物分布研究： 给荷瘤小鼠尾静脉注射约1 MBq（对应20 pmol肽）由药盒制备的177Lu标记肽。在注射后30分钟、4小时、1天、2天、3天和7天处死动物，收取主要器官和组织（肿瘤、血液、肌肉、肝、肾、脾、胃、胰腺、小肠、骨等），用γ计数器测量放射性，计算每克组织摄取注射剂量的百分比（% IA/g）。基于小鼠数据，使用OLINDA/EXM软件进行剂量外推，估算人体首次治疗的可能活度。 * 实验性核素治疗研究： 当肿瘤体积达到约70 mm³时，将小鼠随机分为三组：对照组（注射生理盐水）、低活度治疗组（15 MBq）和高活度治疗组（30 MBq）。每组再分别使用177Lu-DOTA-cyclo-MG1或177Lu-DOTA-cyclo-MG2进行治疗（n=5）。治疗持续5周，每周监测体重和肿瘤体积。通过测量肿瘤长径和短径计算肿瘤体积，并进一步计算特定生长率（Specific Growth Rate, SGR）和肿瘤体积倍增时间（Tumour Volume Doubling Time, TVDT），以量化治疗效果。 * 毒性评估： 在治疗研究期间，定期采集小鼠血液样本。通过全自动血液分析仪监测白细胞（WBC）和血小板（PLT）计数，评估骨髓毒性。通过生化分析仪检测血清肌酐和尿素浓度，评估肾脏毒性。将治疗组与对照组进行比较。

3. 数据分析方法： 所有数据以均值±标准差表示。使用Origin软件进行统计分析，组间比较采用非配对双尾Student’s t检验，以p < 0.05为具有统计学显著性。

四、 主要研究结果 1. 体外表征结果： * 受体亲和力与细胞摄取： DOTA-cyclo-MG1和DOTA-cyclo-MG2对CCK2R均表现出高亲和力，IC50值分别为2.54±0.30 nM和3.23±0.91 nM，与natLu络合后亲和力保持不变。而氧化的DOTA-cyclo-Met(O)-MG1亲和力显著下降（IC50 >100 nM）。细胞摄取实验显示，177Lu-DOTA-cyclo-MG1和177Lu-DOTA-cyclo-MG2在A431-CCK2R细胞中均有较高的特异性内化（~15-16%），显著高于在A431-mock细胞中的摄取（<0.3%）。177Lu-CP04的内化率略高（20.4%），而氧化的177Lu-DOTA-cyclo-Met(O)-MG1几乎无摄取（0.44%），证实了甲硫氨酸氧化会导致活性丧失。 * **稳定性与药盒性能：** 在PBS中，177Lu-DOTA-cyclo-MG2的化学稳定性更高（4小时后RCP >98%），而177Lu-DOTA-cyclo-MG1因甲硫氨酸氧化，RCP在4小时后降至86%。在人血清中，177Lu-DOTA-cyclo-MG1表现出更长的半衰期（30.1小时 vs 17.8小时），但作者指出体外血清稳定性不能完全代表体内代谢情况。药盒评估显示，DOTA-cyclo-MG2药盒在储存6个月后标记产物的RCP仍高达97.8±1.3%，而DOTA-cyclo-MG1药盒在6个月后RCP降至80%以下（含15.1%游离177Lu）。标记产物在室温下存放24小时后，177Lu-DOTA-cyclo-MG2的RCP保持良好（96.3%），而177Lu-DOTA-cyclo-MG1在4小时后RCP即开始显著下降。因此，为DOTA-cyclo-MG2药盒设定的有效期是6个月（标记后24小时内使用），而为DOTA-cyclo-MG1药盒设定的有效期是3个月（标记后4小时内使用）。

2. 体内研究结果： * 生物分布： 两种放射性配体在荷瘤小鼠体内表现出相似的、良好的药代动力学特征。它们在大多数非靶器官中的摄取很低，且在CCK2R阳性肿瘤中的摄取始终高于阴性肿瘤。肾脏摄取非常低，30分钟时最大摄取值分别为1.75% IA/g (MG1) 和2.64% IA/g (MG2)，肿瘤/肾脏比值在4小时时达到2.9-3.1，优于文献中报道的177Lu-CP04（1.6）。在表达CCK2R的正常器官（胃、胰腺）中可见特异性摄取，但随时间下降。177Lu-DOTA-cyclo-MG2在早期时间点于血液和肝脏中的摄取略高，可能与其脂溶性稍强有关。 * 治疗疗效： 实验性核素治疗研究证实了两种放射性配体均具有显著的、受体特异性的抗肿瘤效果。与对照组相比，接受15 MBq和30 MBq治疗的动物，其CCK2R阳性肿瘤的特定生长率（SGR）分别降低了41-44%和60-62%，达到了预设的临床显著性阈值（>30%）。而CCK2R阴性肿瘤的SGR降低幅度较小（13-17%和35-46%）。阳性肿瘤与阴性肿瘤的生长延迟存在统计学显著差异，证明了治疗效果的受体特异性。肿瘤体积倍增时间（TVDT）在治疗组中显著延长：对于阳性肿瘤，177Lu-DOTA-cyclo-MG1治疗使其TVDT延长了1.8倍（15 MBq）和2.6倍（30 MBq）；177Lu-DOTA-cyclo-MG2则分别为1.7倍和2.5倍。高活度组动物体重下降更明显（19-21% vs 8-10%）。 * 治疗毒性： * 骨髓毒性： 呈一过性。15 MBq组在治疗后第一周WBC和PLT计数下降（但仍多在参考值内），随后恢复。30 MBq组下降更显著，WBC和PLT在治疗后1-2周低于参考值下限，但在研究期结束前恢复至可接受水平。 * 肾脏毒性： 在研究期内（最长5周）仅观察到轻微迹象。15 MBq组在后期出现肌酐和尿素水平轻微升高（略超参考上限）。30 MBq组升高更明显，且在研究期内未完全恢复至参考值内。作者指出，长期肾毒性评估需要更长时间的无肿瘤动物研究。

五、 研究结论与价值 本研究成功开发并临床前评估了用于制备177Lu标记环状微胃泌素类似物（DOTA-cyclo-MG1和DOTA-cyclo-MG2）的冻干药盒制剂。其中，基于DOTA-cyclo-MG2（含Nle取代）的药盒在储存稳定性和标记产物稳定性方面更具优势。两种放射性药物均表现出对CCK2R的高亲和力与特异性、有利的药代动力学特征（高肿瘤摄取、低非特异性组织摄取、极低的肾脏滞留）以及明确的受体依赖性抗肿瘤疗效。在双肿瘤小鼠模型中观察到的治疗效果具有统计学显著性和受体特异性。治疗相关的毒性主要表现为一过性的骨髓抑制和轻微的肾脏参数变化，在可控范围内。

本研究的科学价值在于系统验证了环状约束结构在优化微胃泌素类似物治疗性能方面的潜力，特别是通过引入Nle取代Met，解决了氧化不稳定的问题。其应用价值巨大：所开发的标准化药盒制剂极大简化了放射性药物的临床制备流程，保证了产品的质量与可重复性，为后续开展针对CCK2R阳性肿瘤（如晚期甲状腺髓样癌）的首次人体临床试验铺平了道路。研究结果为将这种新型靶向放射配体疗法转化为临床实践提供了全面的临床前数据支持。

六、 研究亮点 1. 创新性的药物设计： 基于截短微胃泌素MG11，设计并合成了具有环状结构的新型类似物（cyclo-MG1/2），并通过Nle（正亮氨酸）取代Met，从根本上避免了甲硫氨酸氧化导致的活性丧失和稳定性问题，这是相较于许多其他MG类似物的关键改进。 2. 一体化的转化研究路径： 研究不仅限于体外活性测试，而是涵盖了从药物化学（结构设计）、放射化学（药盒开发与标记工艺）、体外药理（亲和力、摄取、稳定性）到完整的体内评价（药代动力学、疗效、毒性）的全链条临床前开发流程，数据完整，说服力强。 3. 双肿瘤模型的应用： 在疗效研究中，创新性地使用了在同一动物体内同时接种CCK2R阳性和阴性肿瘤的模型。这种方法能够在同一生物系统内直接、高效地对比和证明治疗的受体特异性，无需额外的阻断实验组，减少了动物使用量并增强了结果的内在说服力。 4. 面向临床的制剂开发： 研究的核心产出之一是一个稳定、可靠、易于操作的冻干药盒配方。对药盒储存期和标记产物有效期的明确规定，是推动其从实验室走向临床药房的关键步骤，具有重要的实际应用价值。 5. 全面的安全性评估： 研究不仅评估了疗效，还系统监测了血液学和肾脏生化指标，对治疗可能引起的骨髓和肾脏毒性进行了初步但重要的刻画，为临床剂量选择和风险监控提供了参考。

七、 其他有价值的内容 研究中对剂量学进行了初步探索，基于小鼠生物分布数据外推至人体，提出了首次人体试验可能采用的活度范围（~3700 MBq/次，分4次治疗），并参考了FDA的异速缩放指南来设计动物治疗剂量（15 MBq和30 MBq），体现了从临床前到临床的转化思维。此外，作者在讨论中理性分析了动物模型中观察到的非特异性肿瘤生长抑制可能源于肿瘤灌注、交叉辐射和全身照射等因素，并指出由于治疗中注射的肽质量较高，可能产生了部分受体阻断效应，这些分析增加了研究的深度和客观性。最后，作者展望了未来临床应用中可能采取的肾保护措施（如氨基酸或明胶基血浆扩容剂输注）和分次治疗策略，以进一步优化治疗窗口。