受面包制作启发的抗氧化多孔酵母微载体用于干细胞递送及糖尿病伤口治疗

主要作者与机构 该研究由Xiangyi Wu、Haofang Zhu、Chuanhui Song、Qian Tan、Yuanjin Zhao以及Luoran Shang共同完成。通讯作者为南京大学医学院附属医院南京鼓楼医院烧伤整形科的Qian Tan、Yuanjin Zhao，以及复旦大学上海徐汇中心医院和生物医学研究院的Luoran Shang。该研究成果于2023年11月27日在线发表于权威学术期刊《Advanced Materials》上。

研究背景 糖尿病溃疡（diabetic ulcers, DU）是糖尿病的一种严重并发症，常导致截肢和残疾。与急性伤口不同，糖尿病溃疡的特征在于持续的炎症期、过度的氧化应激、大量炎症细胞浸润以及促炎因子的过度产生，这些因素共同导致伤口愈合效果不佳。基于干细胞的疗法因其强大的免疫调节和再生特性而备受关注。然而，该疗法在临床转化中面临巨大挑战，主要原因是移植后的干细胞会迅速失活并丧失功能。虽然已有生物材料载体被提出用于递送干细胞并提高其活力和留存率，但这需要对载体的理化特性进行精妙设计。此外，尤为关键的是，糖尿病溃疡伤口微环境中积累的大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）会导致包括成纤维细胞、内皮细胞以及移植干细胞本身在内的多种细胞发生氧化应激损伤和DNA损伤。因此，开发一种既能解决干细胞递送普遍问题，又能提供抗氧化保护的新型平台，对于糖尿病伤口管理具有重大意义。

研究方法与流程 受面包发酵过程中产生大量气孔的原理启发，研究者开发了一种具有抗氧化特性的多孔酵母微载体（yeast microcarriers, YMC）作为干细胞递送的载体。整个研究流程可分为微载体的制备与表征、细胞负载与功能验证、抗氧化性能测试和体内动物实验四个主要环节。

首先，在YMC的制备环节，研究者将微流控乳化技术与酵母介导的发酵过程相结合。他们选用具有优异生物相容性、温度稳定性和光交联特性的甲基丙烯酰化透明质酸（hyaluronic acid methacryloyl, HAMA）水凝胶作为基底材料。具体操作流程是，利用一个双通道微流控芯片装置，将分别含有酵母和葡萄糖的两种HAMA预凝胶溶液并行注入，并在石蜡油的连续相中融合，形成“Janus”双相液滴。这种巧妙的设计可以有效防止在微通道内因过早发酵产生气泡而导致的流体堵塞。随后，这些液滴被引导至一个37℃的加热管道中进行20分钟的发酵，在此过程中酵母消耗葡萄糖并释放二氧化碳，从而在液滴内部产生互连通的孔隙。最后，液滴经过紫外线照射使HAMA交联固化，最终形成YMC。为了消除活体酵母可能带来的感染风险，研究者在保持YMC结构完整的前提下，采用了酶辅助破壁技术对活性酵母进行灭活处理。制备出的YMC大小均一，扫描电子显微镜观察证实其表面及内部均分布着互连通的孔洞结构，为细胞生长和物质交换提供了充足的空间。

其次，在细胞负载与功能验证环节，研究者将YMC浸泡于基质胶溶液后，与脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）悬液共孵育，成功制备了负载ADSCs的微载体复合物（ADSC@YMC）。通过活/死细胞染色、细胞骨架染色以及扫描电镜观察，发现ADSCs在YMC上表现出强劲的粘附、增殖能力和高细胞活力，细胞形态舒展。研究者进一步利用实时定量聚合酶链式反应（q-rt-pcr）技术，在基因水平上评估了负载后ADSCs的功能保持情况。他们检测了多种与促再生能力，特别是促血管生成能力相关的关键因子，结果显示，负载于YMC的ADSCs与未负载的ADSCs相比，这些因子的基因表达水平无显著差异，证明YMC完好地保留了ADSCs的细胞功能。

第三，在抗氧化性能测试环节，研究者首先测定了不同处理方式的YMC浸提液中谷胱甘肽（glutathione, GSH）的含量。结果显示，经过酶辅助破壁处理的YMC（EBW组）能释放出显著高于未处理组（NBW组）的GSH。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除实验也证实，EBW组的自由基清除能力最强。为了验证其对细胞的保护作用，研究者将ADSCs与YMC提取物共培养，随后用过氧化氢诱导氧化应激。流式细胞术和荧光探针检测均表明，YMC能以浓度依赖性的方式有效保护ADSCs免受活性氧损伤。更进一步，在ADSC@YMC复合体上直接诱导氧化应激发现在，对照组细胞内ROS持续积累，而ADSC@YMC组的ROS积累速度则显著延缓长达24小时，细胞死亡率也大幅降低，稳定在约80%的存活率，这为ADSC@YMC在体内高氧化应激环境中维持细胞活性提供了有力证据。

最后，在体内动物实验中，研究者构建了糖尿病小鼠皮肤伤口模型，并设立了磷酸盐缓冲液（PBS）、纯HAMA水凝胶、游离ADSCs、YMC和ADSC@YMC五个处理组。通过12天的连续观察发现，YMC组和ADSC@YMC组的伤口愈合速度显著加快，其中ADSC@YMC组的愈合效果最佳。为了探明机制，研究者使用二氢乙啶（DHE）探针检测了伤口组织中的ROS水平。结果表明，游离ADSC组并未显著降低伤口ROS，这可能是由细胞快速失活和流失所致。而体内成像追踪实验也证实，游离ADSCs在3天内迅速消失，负载于YMC的ADSCs则在伤口处展现出显著增强的存留。与之相应，YMC组和ADSC@YMC组的伤口组织ROS水平显著降低。在组织再生层面，苏木精-伊红染色和马松染色结果显示，ADSC@YMC治疗组的伤口再上皮化程度最高，真皮厚度和胶原蛋白沉积量均显著优于其他组。CD31免疫荧光染色则证实，ADSC@YMC治疗组的新生血管密度大幅增加，展示出强大的促血管生成能力。

主要结果与结论 该研究成功开发了一种将面包制作原理与微流控技术相结合的新方法，制备出具有优越生物相容性、高孔隙率和杰出抗氧化活性的酵母微载体。研究结果表明，该载体不仅能为ADSCs提供理想的生长微环境，保持其细胞活力和功能，还能通过释放GSH有效清除ROS，保护负载和周围的细胞免受氧化应激损伤。体内实验证实，ADSC@YMC复合物能够显著降低糖尿病伤口处的ROS水平，延长移植干细胞的滞留时间，并通过促进血管新生、胶原沉积和肉芽组织形成，极大地加速了糖尿病伤口的愈合与组织再生。这项工作为干细胞治疗糖尿病伤口提供了一个极具前景的递送平台。

研究亮点与价值 本研究的首要亮点在于其仿生学设计理念的创新性，巧妙地借用“面包发酵”这一日常生理过程，以温和、无毒的方式解决了组织工程中多孔支架制备的难题，避免了传统方法中有毒有机溶剂或苛刻条件的使用。其次，该平台实现了“一石二鸟”的功能整合：酵母在发酵阶段作为“造孔剂”构建微载体的物理结构，之后其胞内成分GSH又赋予微载体强大的抗氧化生化功能，精准应对了糖尿病溃疡高氧化应激的病理微环境。此外，将微流控技术与发酵工艺相结合，实现了对微载体尺寸和孔结构的高度可控性。这项研究的科学价值在于，它开辟了一种利用生物活性微生物构建功能性生物材料的新思路；其应用价值则体现在，ADSC@YMC平台直击干细胞疗法在临床应用中细胞存活率低和功能丢失的核心痛点，显著提升了糖尿病溃疡的治疗效果，具有重要的临床转化潜力。该工作不仅为再生医学提供了一种先进工具，也为其他涉及氧化应激损伤的疾病治疗提供了参考。