人参皂苷F3通过RIPOR2介导的免疫代谢重编程缓解T细胞耗竭以增强抗PD-1疗法
作者与发表信息 本研究由来自中国医学科学院广东医院（广州中医药大学第二临床医学院）的蒋梦琳、鲍伟倩、何乐为等作为共同第一作者，刘亮、潘虎丹、李润泽作为通讯作者共同完成。合作单位包括广州国家实验室和中山大学肿瘤防治中心。该研究成果发表于*Phytomedicine*期刊，于2025年11月30日被接收，并于2025年12月3日在线发表，预计刊载于2026年第150卷。
学术背景 本研究属于肿瘤免疫治疗与免疫代谢调控交叉领域。尽管以PD-1抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）在癌症治疗中取得了显著成功，但仅有20-40%的患者能够从中获益。T细胞耗竭（T cell exhaustion, Tex）是导致免疫治疗无效的关键原因之一。耗竭的T细胞表现为效应功能（如细胞因子分泌、细胞毒作用）逐步丧失，并高表达PD-1、TIM-3等抑制性受体。研究表明，T细胞耗竭与免疫代谢紊乱密切相关，肿瘤微环境中的慢性抗原刺激和恶劣的代谢条件（如葡萄糖匮乏、乳酸积累）共同驱动了T细胞的功能失调。然而，T细胞耗竭的分子机制尚未完全阐明，部分原因在于缺乏高效、可重复性强的体外研究模型。同时，开发能够逆转T细胞耗竭、增强现有免疫疗法疗效的药物是当前的重要挑战。人参作为传统中药，其活性成分（如人参多糖、人参皂苷）已被报道具有免疫调节作用，但其与T细胞耗竭的关系尚不明确。因此，本研究旨在：1）建立一个优化的体外T细胞耗竭模型，用于机制研究和药物筛选；2）利用该模型，通过高通量蛋白质组学筛选T细胞耗竭过程中的关键调控分子；3）验证关键分子的功能，并筛选能够靶向该分子的天然小分子化合物；4）在体外和体内（非小细胞肺癌模型）评估该化合物逆转T细胞耗竭及增强抗PD-1疗法疗效的能力。
详细研究流程 本研究包含多个相互关联的实验流程，形成了一个从模型建立、机制探索到药物发现和验证的完整研究链条。
流程一：优化体外T细胞耗竭模型的建立与验证 * 研究对象与样本量： 从6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠脾脏中分离初始CD8+ T细胞。细胞纯度通过流式细胞术验证（≥95%）。 * 处理与实验方法： 采用Belk等人报道的方法并进行优化。首先，使用包被的抗CD3/CD28抗体刺激T细胞48小时以激活和扩增。随后，将细胞持续培养在仅包被抗CD3抗体的板上，每两天更换一次培养基和刺激条件，持续刺激至第10天，以诱导耗竭状态。同时设置急性刺激对照组（Tac），即在激活后转移至未包被的板上培养。该模型的关键优势在于能够从一个单一小鼠中产生大量（约10^8个）具有稳定耗竭表型的T细胞，适用于高通量分析。 * 检测指标： 在刺激过程中的不同时间点（第0、2、4、6、8、10天），通过流式细胞术动态监测T细胞的耗竭表型（PD-1和TIM-3共表达）和效应功能（细胞内IFN-γ、TNF-α、IL-2的分泌）。同时，通过体外杀伤实验，将不同刺激条件下的T细胞与小鼠Lewis肺癌细胞共培养，检测其细胞毒性。
流程二：基于蛋白质组学的耗竭关键调控分子筛选 * 研究对象与样本量： 收集流程一中不同时间点（第0、2、4、6、8、10天）的急性刺激（Tac）和慢性刺激（Tex）CD8+ T细胞，每次收集3×10^6个细胞，进行生物学重复。 * 处理与实验方法： 将细胞样本送至上海生物谱有限公司进行标准化蛋白质组学样本制备和质谱分析。通过主成分分析（PCA）和差异蛋白表达分析，比较Tex与Tac细胞在不同时间点的蛋白质表达谱变化。 * 数据分析流程： 对差异表达蛋白进行基因本体论（GO）和KEGG通路富集分析，以识别在耗竭过程中发生显著改变的核心生物学过程和通路。重点关注在耗竭早期（第4天）即发生显著变化并持续至后期的蛋白。
流程三：关键分子RIPOR2的功能验证 * 研究对象： 体外培养的小鼠原代CD8+ T细胞。 * 处理与实验方法： 1. 表达验证： 通过定量实时PCR验证蛋白质组学发现的候选分子RIPOR2在mRNA水平的表达差异。 2. 临床相关性分析： 利用公共单细胞RNA测序数据集（GSE99254，来自非小细胞肺癌患者；GSE175408，来自小鼠黑色素瘤模型），分析RIPOR2在患者或小鼠模型肿瘤浸润T细胞的不同亚群（如效应T细胞与耗竭T细胞）中的表达情况。 3. 功能缺失实验： 使用siRNA转染技术，在慢性刺激诱导耗竭的模型中敲低CD8+ T细胞中的RIPOR2表达。通过流式细胞术比较敲低组与对照组T细胞的耗竭表型（PD-1+TIM-3+比例）、干细胞样转录因子TCF-1的表达以及效应细胞因子（IFN-γ, TNF-α）的分泌能力。
流程四：靶向RIPOR2的小分子化合物筛选与体外验证 * 研究对象： 体外培养的小鼠原代CD8+ T细胞。 * 处理与实验方法： 1. 分子对接筛选： 使用分子对接技术，从小分子化合物库中筛选与RIPOR2蛋白具有高结合亲和力的候选化合物。人参皂苷F3被鉴定为具有高结合能（-9.6 kcal/mol）的候选分子。 2. 结合验证： 使用表面等离子共振技术进一步验证Ginsenoside F3与RIPOR2蛋白的直接结合亲和力。 3. 体外药效评估： 在慢性刺激诱导T细胞耗竭的模型中，加入不同浓度（0, 0.1, 1, 10 μM）的Ginsenoside F3进行干预。通过流式细胞术检测干预后第4天和第6天T细胞的耗竭表型（PD-1+TIM-3+比例）、RIPOR2的蛋白和mRNA表达水平，以及再刺激后细胞因子的分泌功能。 4. 直接细胞毒性排除实验： 使用CCK-8法检测Ginsenoside F3对多种非小细胞肺癌细胞系（人源H1299、A549，鼠源LLC）以及Jurkat T细胞系的直接增殖抑制作用，以排除其抗肿瘤效果源于直接杀伤肿瘤细胞的可能性。
流程五：体内药效评估及与抗PD-1的协同作用 * 研究对象与样本量： 建立C57BL/6J小鼠的LLC细胞静脉注射转移性非小细胞肺癌模型。将荷瘤小鼠随机分为5组（n=6）：模型组（生理盐水）、Ginsenoside F3单药组（5 mg/kg，腹腔注射，每日）、抗PD-1单药组（200 μg/只，腹腔注射，每3日）、联合治疗组（Ginsenoside F3 + 抗PD-1）、以及健康对照组。 * 处理与实验方法： 1. 治疗与观察： 从接种肿瘤细胞后第1天开始给药，持续28天。定期监测小鼠体重。第29天处死小鼠，收集肺组织。 2. 肿瘤负荷评估： 称量肺重（含肿瘤），通过肉眼观察和H&E染色评估肺内肿瘤结节的数量和大小。 3. 肿瘤免疫微环境分析： 消化肿瘤组织获得单细胞悬液，通过流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞中CD4+和CD8+ T细胞的比例，以评估Ginsenoside F3对免疫细胞浸润的影响。
主要研究结果 1. 体外耗竭模型成功复现了T细胞耗竭的关键表型与功能缺陷。 慢性抗CD3刺激能有效诱导CD8+ T细胞进入耗竭状态。从第4天开始，出现PD-1+TIM-3+双阳性细胞群（~13.4%），至第6天达到峰值（~58.1%）。功能上，与急性刺激细胞相比，慢性刺激细胞分泌IFN-γ的能力在第6天降低了约20倍，且体外杀伤LLC肿瘤细胞的能力显著下降。这证实该模型能够稳定产生具有典型耗竭特征的T细胞，适用于后续机制研究。
2. 蛋白质组学揭示代谢通路重编程，并鉴定出RIPOR2为耗竭关键负调控因子。 PCA分析显示，从第4天起，Tex与Tac细胞的蛋白质表达谱出现明显分离。差异蛋白分析发现，第4、6、8天共有1445个蛋白持续差异表达，其中代谢相关通路（如糖酵解、氧化磷酸化）显著富集。Rho家族相互作用细胞极化调节因子2在耗竭细胞中表达持续显著下调。qPCR验证显示，Tex细胞中RIPOR2的mRNA水平仅为Tac细胞的约1/15（约7%）。对公共单细胞测序数据的分析进一步证实，在临床肺癌患者和小鼠肿瘤模型的肿瘤浸润T细胞中，耗竭T细胞亚群的RIPOR2表达显著低于效应T细胞亚群。
3. RIPOR2功能缺失加剧T细胞耗竭。 siRNA敲低RIPOR2后，在慢性刺激条件下，CD8+ T细胞中PD-1+TIM-3+终末耗竭亚群的比例进一步增加，而干细胞样转录因子TCF-1+的祖细胞前体耗竭亚群比例减少。同时，敲低细胞的效应功能进一步受损，IFN-γ和TNF-α的分泌水平显著降低。这证明RIPOR2的下调是驱动而非伴随T细胞耗竭进程的重要因素。
4. Ginsenoside F3靶向RIPOR2并有效逆转体外T细胞耗竭。 分子对接和表面等离子共振证实Ginsenoside F3能与RIPOR2稳定结合。在体外耗竭模型中，Ginsenoside F3干预能以剂量依赖的方式降低PD-1+TIM-3+耗竭T细胞的比例（例如，10 μM处理在第4天使该比例从16.1%降至9.8%）。同时，Ginsenoside F3能显著上调耗竭T细胞中RIPOR2的mRNA和蛋白表达水平。功能上，Ginsenoside F3处理恢复了耗竭T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力，且这种恢复作用呈剂量依赖性。CCK-8实验表明，Ginsenoside F3在有效浓度范围内（≤10 μM）对肿瘤细胞无直接杀伤作用，但能促进Jurkat T细胞的增殖。
5. Ginsenoside F3在体内与抗PD-1疗法协同抑制肿瘤生长。 在LLC转移性肺癌小鼠模型中，Ginsenoside F3单药或抗PD-1单药治疗均能一定程度上减轻肿瘤负荷（肺重降低），但联合治疗显示出显著的协同效应。联合治疗组的肺肿瘤重量显著低于模型组和抗PD-1单药组，肿瘤结节更少、更小。H&E染色显示联合治疗组肺组织肿瘤浸润减少，正常肺泡结构保留更多。治疗期间小鼠体重稳定，表明Ginsenoside F3无明显毒性。
6. Ginsenoside F3通过增强CD8+ T细胞肿瘤浸润发挥协同作用。 流式分析肿瘤免疫微环境发现，联合治疗显著增加了肿瘤内CD8+ T细胞的浸润比例（从模型组的~20%提升至~37%），同时也提高了CD4+ T细胞的比例。这表明Ginsenoside F3通过逆转T细胞耗竭、增强T细胞功能，从而为抗PD-1疗法提供了更多可被“重启”的功能性T细胞，最终实现协同抗肿瘤效果。
结论与意义 本研究得出以下核心结论：1）RIPOR2是CD8+ T细胞耗竭过程中一个关键的免疫代谢负调控因子，其表达下调与耗竭表型和功能缺陷密切相关。2）人参皂苷F3能够靶向RIPOR2，通过上调其表达来逆转T细胞的耗竭状态，恢复其效应功能。3）在非小细胞肺癌模型中，Ginsenoside F3与抗PD-1抗体联合应用能产生显著的协同抗肿瘤效应，其机制与增加肿瘤内功能性CD8+ T细胞的浸润有关。
本研究的科学价值在于：首先，建立了一个高效、可重复的体外T细胞耗竭模型，为耗竭机制研究和药物筛选提供了有力工具。其次，通过蛋白质组学方法发现了RIPOR2这一新的T细胞耗竭相关分子，拓展了对耗竭调控网络的理解，特别是将细胞骨架和细胞极化相关蛋白与T细胞代谢和功能衰竭联系起来。最后，将传统中药活性成分Ginsenoside F3与现代免疫代谢调控理论相结合，不仅为其抗肿瘤免疫增强作用提供了新的分子机制解释（靶向RIPOR2），也为开发基于天然产物的免疫治疗增敏剂提供了先导化合物和理论依据。
研究亮点 1. 模型创新性： 成功优化并验证了一个能够大规模产生稳定耗竭表型T细胞的体外模型，解决了体内模型细胞量少、成本高、通量低的问题，适用于高通量筛选。 2. 机制新颖性： 首次将RIPOR2鉴定为T细胞耗竭的关键调控因子，并阐明其功能缺失会加剧耗竭，这为理解T细胞功能失调提供了新的视角。 3. 药物发现与机制验证的闭环： 从蛋白质组学发现靶点（RIPOR2），通过分子对接筛选出先导化合物（Ginsenoside F3），并在体外和体内完整验证了“化合物-靶点-功能-表型-疗效”的逻辑链条，研究设计严谨。 4. 转化潜力： 明确展示了Ginsenoside F3作为免疫代谢调节剂，能够与现有免疫检查点抑制剂（抗PD-1）协同增效，为克服免疫治疗耐药提供了新的联合策略，具有明确的临床转化前景。 5. 多维度验证： 结合了体外模型、体内动物模型、公共临床数据集分析、分子/细胞/组织等多个层次的研究手段，证据链完整。
其他有价值的内容 研究在讨论部分将Ginsenoside F3与目前处于研究热点的其他免疫代谢调节剂（如二甲双胍、CPI-613、IDO1抑制剂等）进行了对比分析，指出了其作用机制（靶向T细胞内在代谢调节蛋白RIPOR2以增强其功能韧性）的独特性和潜在优势。同时，作者也客观指出了本研究的局限性，例如Ginsenoside F3的药代动力学特性有待优化，以及需要在人源T细胞和更复杂的人类肿瘤微环境模型中进行验证，为后续研究指明了方向。