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人类γδ T细胞受体-CD3复合物的结构解析及其免疫学意义

作者及机构
本研究由Weizhi Xin、Bangdong Huang、Ximin Chi等共同完成，通讯作者为Qiang Su和Qiang Zhou。研究团队来自中国杭州西湖大学的Research Center for Industries of the Future、Westlake Laboratory of Life Sciences and Biomedicine等机构。论文于2024年6月6日发表在Nature期刊（第630卷）。

学术背景

γδ T细胞是脊椎动物免疫系统中的独特亚群，兼具先天性和适应性免疫特性，在抗感染、抗肿瘤和组织稳态中发挥关键作用。其表面表达的γδ T细胞受体（TCR）能够独立于主要组织相容性复合体（MHC）识别多种抗原，包括磷酸化代谢物（如Vγ9Vδ2 TCR识别的磷酸抗原）和脂类抗原（如Vγ5Vδ1 TCR识别的CD1d-糖脂复合物）。然而，γδ TCR与CD3复合物的完整结构及其组装机制尚不明确，这限制了对其信号转导和免疫治疗潜力的深入理解。

本研究旨在解析两种典型人类γδ TCR-CD3复合物（Vγ9Vδ2和Vγ5Vδ1）的冷冻电镜结构，揭示其独特的组装机制，并探讨其在T细胞激活中的功能差异。

研究流程与方法

1. 蛋白复合物的制备与纯化

• 构建表达系统：将TCR的γ链、δ链与CD3亚基（CD3εγ、CD3εδ、CD3ζζ）的基因克隆至优化载体中，在ExpiHEK293F细胞中表达。
  
• 纯化策略：通过Flag标签和Strep标签两步亲和层析纯化复合物，使用尺寸排阻色谱（SEC）验证其单体和二聚体状态。Vγ9Vδ2复合物为单体，而Vγ5Vδ1复合物因分子量更大，SEC洗脱体积更小，提示其为二聚体。
  
• 去垢剂优化：为减少冷冻电镜数据中的胶束干扰，Vγ9Vδ2复合物纯化时采用LMNG（lauryl maltose neopentyl glycol）和胆固醇半琥珀酸酯（CHS）替代传统去垢剂Gdn。
  

2. 功能验证实验

• 细胞模型：构建稳定表达Vγ9Vδ2或Vγ5Vδ1 TCR的Jurkat-76细胞系，与抗原呈递细胞（K562细胞）共培养，通过流式细胞术检测T细胞激活标志物CD69的上调。
  
• 连接肽（Connecting Peptide, CP）功能研究：设计嵌合TCR（将γδ TCR的CP替换为αβ TCR的CP），发现CP长度和灵活性影响配体结合与T细胞激活。例如，Cγ2亚型的CP更长且无二硫键，导致更高的配体结合能力但激活效率降低。
  

3. 冷冻电镜结构解析

• 数据采集：使用300 kV冷冻电镜（Thermo Fisher Krios）采集图像，通过MotionCor2和CryoSPARC进行运动校正和三维重构。
  
• 结构解析：
  
  • Vγ9Vδ2 TCR-CD3：分辨率达3.4 Å，显示其为单体，胞外域（ECD）和连接肽具有高度构象灵活性。跨膜区（TM）存在胆固醇样分子，通过氢键网络稳定复合物。
    
  • Vγ5Vδ1 TCR-CD3：通过局部重构获得ECD（3.0 Å）、跨膜区（3.9 Å）和整体低分辨率（9.5 Å）结构，证实其为二聚体，两个原体通过Vγ5域的背对背相互作用组装。
    

4. 胆固醇的调控作用

• 突变实验：构建TM区突变体（如tcrδ2的F283A/F290A/F291A），发现胆固醇结合缺失导致CD3ζ构象变化，增强T细胞激活。
  
• 胆固醇耗竭实验：使用ALOD4蛋白耗竭细胞膜胆固醇后，γδ TCR信号显著增强，证实胆固醇对TCR信号转导的抑制作用。
  

5. 二聚化机制与功能验证

• Vγ5域的关键作用：Vγ5二聚化界面由保守的Tyr106和Arg120介导，形成“Arg-Tyr-Tyr-Arg”簇。通过荧光寿命成像（FLIM-FRET）证实Vγ5或Vγ2 TCR-CD3在细胞膜上形成二聚体，而其他Vγ亚型（如Vγ9）为单体。
  
• 功能丧失突变：引入Y106E/R120H突变后，Vγ5Vδ1 TCR丧失二聚化能力，且无法激活T细胞，表明二聚化是T细胞激活的必要条件。
  

主要研究结果

1. 两种γδ TCR-CD3的组装机制：

   • Vγ9Vδ2为单体，依赖跨膜区胆固醇稳定；Vγ5Vδ1为二聚体，通过Vγ5域相互作用组装。
     
   • 二聚化机制由Vγ亚型决定，提示γδ TCR的功能多样性可能与其寡聚状态相关。
     

2. 连接肽的调控作用：

   • CP长度和灵活性影响配体结合与信号转导。Cγ2亚型因CP更长，虽增强配体结合，但降低激活效率。
     

3. 胆固醇的抑制作用：

   • 胆固醇通过嵌入跨膜区抑制TCR信号，其耗竭可增强γδ T细胞响应，这一机制与αβ TCR类似。
     

4. 二聚化的生物学意义：

   • 二聚化是Vγ5Vδ1 TCR激活的必要条件，可能通过增加配体结合价（如CD1d-糖脂的双价结合）增强信号。
     

研究结论与价值

1. 科学价值：

   • 首次揭示γδ TCR-CD3复合物的两种组装模式，填补了γδ TCR结构生物学的空白。
     
   • 阐明了胆固醇和连接肽在TCR信号调控中的保守性与独特性。
     

2. 应用潜力：

   • 为设计基于γδ TCR的免疫疗法（如CAR-γδ T细胞）提供结构基础，尤其是针对Vγ5Vδ1的二聚化特性可优化靶向性。
     
   • 胆固醇调控机制的发现提示可通过调节膜脂质环境增强γδ T细胞的抗肿瘤活性。
     

研究亮点

1. 技术创新：

   • 结合冷冻电镜局部重构与FLIM-FRET，解决二聚体结构的动态异质性难题。
     
   • 开发嵌合TCR模型，首次证明CP长度对γδ TCR功能的直接影响。
     

2. 理论突破：

   • 提出“Vγ亚型决定寡聚状态”的新范式，解释了γδ TCR的功能多样性。
     
   • 发现胆固醇的抑制作用在γδ和αβ TCR中的保守性，深化了对TCR信号调控的理解。
     

其他重要发现

• 抗原识别模式的启示：γδ TCR的胞外域灵活性类似抗体Fab段，可能通过多种几何构象识别非经典抗原，这一特性与其“类抗体”功能一致。
  
• HV4区的进化意义：Vγ5二聚化界面由高度保守的HV4区介导，提示其可能在进化中保留了特定的免疫监视功能。
  

以上内容全面涵盖了该研究的背景、方法、结果与意义，为相关领域的研究者提供了系统的参考。