金匮肾气丸（Jinkui Shenqi Wan, JKSQW）治疗糖尿病肾病（diabetic kidney disease, DKD）的ceRNA调控网络机制研究：一项网络药理学与生物信息学整合分析

主要作者与发表信息

该研究由Yao Xu、Qingying Tan、Tianxiao Hu、Yanxia Ren、Jiaqi Yao、Xiujing Wang及通讯作者Peiwu Jiang等共同完成。作者团队来自中国人民解放军联勤保障部队第903医院内分泌科（浙江杭州）与浙江中医药大学附属杭州中医医院血管外科。该文作为开放获取论文发表于Medicine期刊2026年第105卷第16期（文章编号e48377），并于2025年11月6日投稿，2026年4月1日接受，最终在线发表于2026年。研究受浙江省医药卫生科技计划（项目编号2025KY1190）和浙江省中医药科技计划（项目编号2025ZL103）资助。

研究背景与目的

糖尿病肾病是糖尿病最常见且严重的微血管并发症之一，约累及三分之一的糖尿病患者，是全球终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的首要病因。尽管目前已有肾素—血管紧张素—醛固酮系统（renin–angiotensin–aldosterone system, RAAS）阻断剂、钠—葡萄糖协同转运蛋白2（sodium–glucose cotransporter 2, SGLT2）抑制剂、GLP-1受体激动剂以及非甾体盐皮质激素受体拮抗剂等标准治疗手段，但仍有大量患者进展至肾衰竭。因此，探索新的治疗策略具有重要临床意义。

金匮肾气丸出自《金匮要略》，由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、茯苓、牡丹皮、桂枝及附子八味药组成，临床广泛用于肾阳不足、水液代谢障碍相关病证，包括糖尿病肾病。既往实验研究表明JKSQW具有抗炎、免疫调节及抗纤维化作用，但其分子机制尚不完全清楚。近年来，非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA），尤其是环状RNA（circular RNA, circRNA）和微小RNA（microRNA, miRNA），在DKD发病机制中的调控作用日益受到关注。circRNA可充当竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）吸附miRNA，进而调节下游mRNA表达，影响氧化应激、炎症、纤维化和足细胞凋亡。然而，JKSQW是否通过调节circRNA–miRNA–mRNA网络发挥治疗作用尚未被系统阐明。本研究旨在整合网络药理学与ceRNA调控网络分析，揭示JKSQW治疗DKD的潜在分子机制。

研究流程与方法

本研究为一项纯生物信息学与网络药理学研究，基于公开数据库资源，未涉及人体或动物实验，因此无需伦理审查。研究流程可分为六个主要步骤。

第一步，筛选JKSQW活性成分及潜在靶点。从中医药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）检索JKSQW八个组成药材的化学成分，采用口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥30%和类药性（drug-likeness, DL）≥0.18作为筛选标准。随后从TCMSP及STITCH数据库获取候选化合物对应的蛋白质靶点，并利用UniProt数据库将靶点标准化为人类官方基因符号，剔除重复后得到JKSQW相关靶点集合。

第二步，识别DKD相关差异表达mRNA（differentially expressed mRNAs, DEmRNAs）及ncRNA互作关系。从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）下载DKD相关转录组数据集GSE1009（平台GPL16791，人源样本），使用R软件中的DESeq2包进行差异表达分析。低丰度基因（行和≤10）被过滤，以负二项分布模型估计离散度，采用Wald检验进行组间比较，并以Benjamini–Hochberg法校正多重检验。校正后p<0.05且|log2 fold change|>2的基因被定义为显著差异表达。circRNA–miRNA相互作用通过miRcode数据库预测，并尽可能与StarBase数据库交叉验证；miRNA–mRNA相互作用整合自miRDB、miRTarBase和TargetScan数据库，仅保留至少两个数据库支持或经miRTarBase实验验证的配对用于后续网络构建。

第三步，确定药物—疾病重叠靶点。将预测的JKSQW靶点与DKD相关DEmRNAs取交集，所得重叠基因作为JKSQW治疗DKD的潜在治疗靶点，并利用Venny 2.1.0进行可视化。

第四步，蛋白—蛋白相互作用（protein–protein interaction, PPI）网络构建与核心基因识别。将重叠靶点提交至STRING数据库，物种限定为人类，置信度阈值设为>0.9，构建PPI网络。网络导入Cytoscape软件（版本3.7.1）进行可视化与拓扑分析，根据度中心性（degree centrality）识别枢纽基因。

第五步，功能富集分析。利用R语言clusterProfiler包对重叠靶点进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析，校正后p<0.05的条目视为显著富集，并以柱状图和气泡图展示结果。

第六步，分子对接与可视化。从蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）获取核心靶蛋白三维结构，利用PyMOL（版本2.5）和AutoDockTools（版本1.5.6）进行结构准备，包括去除水分子和共结晶配体、添加极性氢及分配Gasteiger电荷。代表性活性化合物结构从PubChem数据库下载并进行能量最小化。采用AutoDock Vina进行分子对接模拟，穷尽性参数设为8，对接格子以共结晶配体定义的活性位点为中心。选取结合自由能最低构象作为最优对接姿势，利用PyMOL可视化对接复合物，并使用蛋白质—配体相互作用分析器（Protein–Ligand Interaction Profiler, PLIP）分析非共价相互作用。

主要研究结果

成分与靶点筛选结果显示，基于OB≥30%和DL≥0.18标准，从JKSQW八个组成药材中共鉴定出50个生物活性化合物，映射到218个非冗余人类潜在靶点。各药材贡献不均，牡丹皮预测靶点数最多（去重前220个），泽泻最少（9个），体现了方剂多成分、多靶点的药理复杂性。

差异表达分析在GSE1009数据集中鉴定出543个显著DEmRNAs（校正后p<0.05，|log2FC|>2）。circRNA–miRNA预测获得420个具有潜在miRNA结合能力的circRNA，进一步分析得到109个miRNA。整合多个数据库后获得2661对miRNA–mRNA相互作用，经多数据库支持筛选以提高可靠性。

将218个JKSQW靶点与543个DKD相关DEmRNAs取交集，得到20个重叠基因，作为JKSQW潜在治疗靶点。PPI网络分析显示，这20个靶点形成包含16个节点和86条边的高连接度蛋白质模块，并非孤立的分散靶点。度中心性分析确定HTR2A、EGFR、TOP2A、CDK1和MYC为前5位枢纽基因，其中HTR2A的度值最高（16），显示其在该网络中的核心调控地位。将预测的ncRNA关系整合后，构建了包含20个mRNA、32个miRNA和50个circRNA的多层次circRNA–miRNA–mRNA调控网络。其中circ_0000962–miR-15a-5p–CDK1轴表现为高度互联的模块，可能代表JKSQW发挥调控效应的潜在ceRNA机制。

GO富集分析共获得859个显著富集条目，涉及对外部刺激的响应、细胞周期相关事件调控等生物学过程；细胞组分富集包括cyclin B1–CDK1复合物和DNA拓扑异构酶II复合物；分子功能以激酶激活活性为主。KEGG通路分析共鉴定出53条显著富集通路，其中与DKD最相关的是糖尿病并发症中的AGE–RAGE信号通路和p53信号通路。这两条通路与氧化应激、细胞凋亡、炎症及纤维化重塑密切关联，是DKD发病的关键病理环节。

分子对接结果显示，代表性化合物豆甾醇（stigmasterol）与4个核心靶蛋白均表现出良好的结合亲和力，结合自由能在−7.6至−8.7 kcal/mol之间。其中与CDK1的结合最强（−8.7 kcal/mol），其次为HTR2A（−8.3 kcal/mol）、TOP2A（−7.8 kcal/mol）和EGFR（−7.6 kcal/mol），提示豆甾醇可能作为JKSQW药理网络中的多靶点调节剂发挥作用。

研究结论与价值

本研究通过整合网络药理学与ceRNA调控网络分析，揭示了金匮肾气丸可能通过多成分、多靶点方式，同时介入AGE–RAGE与p53信号通路，调节circRNA–miRNA–mRNA调控网络，从而减轻糖尿病肾病的病理损伤。枢纽蛋白HTR2A、EGFR、TOP2A、CDK1和MYC代表JKSQW同时抑制炎症、抑制异常增殖/细胞周期阻滞及减少基质重塑的关键调控节点。circ_0000962–miR-15a-5p–CDK1轴将ncRNA调控与细胞周期程序偶联，为JKSQW减轻足细胞应激、系膜扩张和肾小管间质纤维化提供了可检验的机制假设。分子对接结果进一步支持豆甾醇等多靶点活性成分通过调控上述网络节点发挥肾保护作用。

该研究的科学价值在于将ceRNA网络整合进传统网络药理学框架，拓展了中药复方机制研究的方法学范式；应用价值在于为JKSQW治疗DKD的传统应用提供了现代系统药理学依据，并为后续分子验证和治疗优化建立了可转移的分析框架。研究同时指出了局限性，包括完全依赖公开数据与计算机预测，所提出的实验验证（如共表达分析、荧光素酶报告基因实验、功能获得/缺失及回补实验、RNA-FISH定位等）均为未来工作方向。未来整合单细胞转录组、AGO-RIP/CLIP-seq及分子动力学模拟将有助于进一步明确枢纽基因和ncRNA在肾脏各细胞组分中的定位与功能。