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本研究由来自吉林大学化学学院分析化学系的王培琳、梁子辉、李文艳、李振润以及通讯作者马强共同完成。研究成果于2025年2月21日在线发表于美国化学会期刊《Analytical Chemistry》，该论文的卷号为97，页码为4635至4642，数字对象唯一标识符（DOI）为10.1021/acs.analchem.4c06670。

胶质母细胞瘤（glioblastoma, GBM）是中枢神经系统中最常见且致死率最高的脑肿瘤。由于血脑屏障的存在，脑脊液形成了一个相对封闭的微环境，因此脑脊液的液体活检被认为是一种提高GBM诊断准确性的有效途径。细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是由细胞释放的纳米级脂质双分子层囊泡，参与细胞间通讯，被认为是极具前景的癌症诊断生物标志物。特别是GBM细胞释放到脑脊液中的EVs，有潜力成为GBM临床诊断的特异性标志物。蛋白质的糖基化是一种重要的翻译后修饰，参与EVs的生物发生、细胞识别及受体细胞摄取等过程，与肿瘤进展密切相关。然而，现有的EV糖基化分析方法如质谱和凝集素阵列，通常需要复杂的分离和破坏性蛋白释放过程，且成本高昂。邻位标记技术作为一种揭示分子定位信息的有力工具，通过空间受限的酶促修饰和邻近生物分子反应，能够生成共价标记来反映蛋白质特征。同时，等离激元纳米腔（plasmonic nanocavity）因其在纳米尺度上集中和增强电磁场的能力而受到关注，但腔内局域电磁场的不均匀性会导致纳米发射体的增强不一致，因此需要开发具有均匀场分布模式的纳米腔，以整合纳米发射体和目标物，实现高精度生物传感。本研究的目标是开发一种基于自定位等离激元纳米腔的电化学发光（electrochemiluminescence, ECL）策略，用于检测EVs上程序性死亡配体1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）的糖基化。

本研究的工作流程主要分为四个阶段。第一阶段是合成与修饰二硒化钼量子点（MoSe₂ quantum dots, MoSe₂ QDs）。研究者采用微波辅助水热法，将硒酸钠和钼酸铵在硼氢化钠存在下于160摄氏度加热1小时，合成出粒径约为6纳米的MoSe₂ QDs。随后通过谷胱甘肽进行羧基功能化，并利用EDC/NHS活化后连接链霉亲和素（streptavidin），得到MoSe₂ QD-链霉亲和素复合物。第二阶段是构建金纳米环阵列并捕获EVs。首先在电极表面构建工程化磷脂双分子层，然后通过界面自组装法将金纳米环有序排列在脂质双分子层上。接着将胆固醇修饰的CD63适配体锚定在脂质双分子层上，用于捕获GBM来源的EVs并诱导膜融合过程。第三阶段是进行多功能邻位标记。研究者将辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）与PD-L1适配体偶联形成催化探针。在过氧化氢存在下，HRP催化含酚分子转化为活性酚氧自由基，由于自由基寿命短（小于1毫秒）且标记半径受限（小于20纳米），实现了对邻近电子丰富氨基酸的共价连接。为了特异性标记PD-L1上的唾液酸（sialic acid, SA），首先通过温和的高碘酸盐氧化在SA的C7位引入醛基，然后以苯胺为催化剂，通过肟连接反应将酪氨酸酰肼连接到SA上，为邻位标记提供结合位点。最后，通过HRP介导的邻位标记反应将生物素-苯酚连接到SA上。第四阶段是构建自定位等离激元纳米腔并进行临床样本分析。通过生物素与链霉亲和素的亲和反应，依次引入MoSe₂ QDs和生物素修饰的金纳米立方体，在电极表面形成自定位等离激元纳米腔。ECL测试在含有50毫摩尔过氧化氢的磷酸盐缓冲液中进行，扫描速率为100毫伏每秒，扫描电压范围为-2.5至0伏。临床脑脊液样本通过腰椎穿刺从胶质瘤患者获取，经离心去除细胞和碎片后，使用商业试剂盒提取EVs。

MoSe₂ QDs的表征结果显示，透射电子显微镜图像显示其粒径均匀，约为6纳米。紫外-可见光谱显示其在235纳米处有吸收峰，荧光光谱显示其在410纳米处有荧光峰。傅里叶变换红外光谱证实了羧基等官能团的存在。ECL测试表明，MoSe₂ QDs在含过氧化氢的磷酸盐缓冲液中表现出显著的ECL响应，且过氧化氢浓度为50毫摩尔时ECL信号最强，其ECL峰位于555纳米。循环伏安曲线显示在-1.1伏处有一个还原峰，证明过氧化氢作为共反应剂参与了MoSe₂ QDs的ECL生成。对于GBM来源EVs的验证，纳米颗粒跟踪分析显示EVs原始浓度为6.0×10⁷颗粒每毫升，粒径集中在约70纳米。蛋白质印迹分析确认了CD63和PD-L1在EVs上的表达。通过荧光显微镜验证了膜融合过程的发生。多功能邻位标记的可行性验证实验中，使用FAM标记的PD-L1适配体和Cy5标记的链霉亲和素分别指示PD-L1和SA，荧光显微镜成像显示糖基化PD-L1的信号，而对照组未显示明显的红色荧光信号。ECL检测也证实了与对照组相比，糖基化PD-L1标记的MoSe₂ QDs产生了明显的ECL响应。在构建自定位等离激元纳米腔后，扫描电子显微镜图像显示金纳米环平均直径为100纳米，金纳米立方体边长为50纳米，且金纳米立方体位于金纳米环顶部。理论模拟结果表明，电磁场分布在金纳米立方体和金电极表面之间，并在金纳米环限制区域内均匀增强。ECL调制效应研究表明，金纳米环阵列使MoSe₂ QDs的ECL强度增强1.3倍，金纳米立方体使其增强2倍，而自定位纳米腔实现了2.5倍的ECL信号增强。极化ECL测量显示，自定位纳米腔使ECL信号集中并转化为在40度和220度方向的高强度极化发射，实现了4倍的极化ECL增强。在检测性能方面，电化学阻抗谱证实了传感系统构建过程中各步骤的成功。该传感系统对EVs的检测线性范围为1.0×10³至1.0×10⁶颗粒每毫升，线性方程为y = 467.9x - 1109，相关系数r²为0.9934，检测限计算为530颗粒每毫升。选择性测试表明，该系统对EVs具有明显的ECL响应，而对唾液酸、黏蛋白1和人血清白蛋白等干扰物的响应可忽略。临床样本分析显示，GBM患者脑脊液中EVs的PD-L1糖基化表达水平显著高于低级别胶质瘤患者，包括少突星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。肿瘤组织中EVs的检测结果也呈现相似趋势，而健康个体血清中未检测到EV PD-L1糖基化。

本研究的结论是，成功构建了一种新型的自定位等离激元纳米腔基ECL传感系统，用于分析脑脊液中EVs的糖基化。该策略结合了目标定位和光学调制功能。通过多功能过氧化物酶诱导的邻位标记过程，SA分子被转化为反应底物，实现了对EVs上糖基化PD-L1的识别。在EVs标记过程中，MoSe₂ QDs自发定位于纳米腔内均匀增强的电磁场区域，其极化ECL信号以高分辨率集中。糖基化PD-L1在GBM患者脑脊液中的EVs上呈现高表达水平，EVs糖基化特征的分析可用于辅助GBM的诊断。未来研究将聚焦于整合糖基化与蛋白质和核酸信息，以实现更精确的基于EVs的液体活检。

本研究的亮点主要体现在以下几个方面。首先，开发了一种自定位等离激元纳米腔策略，将金纳米环阵列和金纳米立方体结合，实现了均匀增强的电磁场环境，解决了传统等离激元纳米腔内电磁场分布不均的问题。其次，设计了一种多功能邻位标记方法，通过HRP催化反应和高碘酸盐氧化-肟连接反应的组合，实现了对特定蛋白PD-L1上唾液酸糖基化的精确标记。第三，该传感系统具有高灵敏度和高特异性，检测限达到530颗粒每毫升，且能区分不同级别的胶质瘤患者。第四，该研究将EVs糖基化作为潜在的诊断标志物，为GBM的液体活检提供了新的思路，具有重要的临床应用价值。此外，该研究还展示了等离激元纳米腔对ECL信号的极化调制能力，为光学调控和生物传感的结合提供了新的范例。