本研究题为“Shuangshen Ningxin capsule alleviates myocardial ischemia–reperfusion injury in miniature pigs by modulating mitophagy: network pharmacology and experiments in vivo”，由Feifan Jia、Yuanyuan Chen、Lei Li（通讯作者）及Jianhua Fu（通讯作者）等学者完成，研究单位为中国中医科学院西苑医院国家中医心血管病临床研究中心。该成果发表于 Chinese Medicine 期刊（2023年，第18卷，文章编号120），并于2023年5月29日收稿，同年7月20日被接收。
急性心肌梗死是冠状动脉粥样硬化性心脏病的危重类型，对人类健康构成重大威胁。恢复血流再灌注是目前最有效的治疗手段，然而再灌注本身却是一把“双刃剑”——它在挽救缺血心肌的同时，不可避免地导致心肌超微结构进一步恶化及心功能受损，甚至引发不可逆性损伤，这一病理过程被称为心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI）。目前针对MI/RI尚无确切有效的治疗方法，深入探索安全有效的干预策略具有重要临床意义。
双参宁心胶囊（Shuangshen Ningxin capsule, SSNX）是由中国中医科学院西苑医院研制的中药复方制剂，由人参、丹参和延胡索组成，其主要活性成分人参总皂苷、丹参总酚酸和延胡索总生物碱的比例为1:1:1.25。前期研究表明，SSNX能显著降低心肌酶活性、缩小心肌梗死面积、改善心肌水肿及炎症浸润，并通过保护三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）及开放线粒体ATP敏感性钾通道来保护大鼠免受MI/RI。然而，SSNX干预MI/RI的主要生物活性成分及其特异性保护机制尚不明确。鉴于啮齿类动物与人类在生理结构上存在显著差异，而小型猪的心脏生理结构与人类更为接近，因此本研究旨在通过构建小型猪MI/RI模型验证SSNX的药效作用，并整合网络药理学、分子对接及体内实验验证，系统阐明SSNX抗MI/RI的潜在机制。
本研究包含四个主要环节：药效学评价、网络药理学分析、分子对接验证及机制实验验证。
1. 药效学评价——小型猪MI/RI模型构建与SSNX干预
实验选用5至8月龄、体重25至35千克的雄性巴马小型猪30头，随机分为5组，每组6头：对照组（Control）、模型组（Model）、尼可地尔组（Nicorandil, 1.2 mg/kg，阳性对照）、SSNX治疗组（SSNX-tre, 20 mg/kg，造模后给药7天）及SSNX预防组（SSNX-pre, 20 mg/kg，造模前预防给药7天）。MI/RI模型构建方法为：以3%戊巴比妥钠静脉麻醉后，分离右颈总动脉并置入6F动脉鞘管，在C型臂X光机透视下将6F JR 3.5指引导管置于左冠状动脉开口行冠状动脉造影，观察冠脉分布后，将导丝置于左前降支（left anterior descending branch, LAD）中段，根据血管直径以8至12个大气压扩张球囊阻断LAD血流，阻断30分钟后撤出球囊完成再灌注。术后15分钟行心电图检查，以II导联出现ST段抬高、病理性Q波或T波倒置等改变作为模型成功的判断标准。
术后第7天进行以下检测：采用Vivid S5彩色多普勒超声诊断仪行M型超声心动图检查，测量左心室舒张末期内径（LVIDd）、收缩末期内径（LVIDs），并计算射血分数（ejection fraction, EF）和短轴缩短率（fractional shortening, FS）；采集右股动脉血液测定血清肌酸激酶（creatine kinase, CK）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T, cTnT）及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）含量；处死动物后取心脏行氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium, NBT）染色测定心肌梗死面积（梗死区面积/左心室总面积×100%）；同时取心肌组织行苏木精-伊红（hematoxylin eosin, HE）染色和马松（Masson）三色染色观察组织病理学改变。
2. 网络药理学分析
首先通过高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）技术鉴定SSNX中的主要化学成分。利用PubChem数据库获取活性成分的二维结构，并导入SwissTargetPrediction数据库预测其作用靶点，共匹配到15种活性成分的201个靶点。以“myocardial ischemia-reperfusion injury”为关键词，检索OMIM和GeneCards数据库获取MI/RI相关靶点，取相关性评分大于中位数的靶点作为潜在疾病靶点，共获得645个。将药物靶点与疾病靶点取交集后，得到75个SSNX治疗MI/RI的潜在作用靶点。
将75个交集靶点导入STRING 11.0数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络（物种：智人，综合评分>0.7）。利用Cytoscape 3.9.0软件进行网络可视化，并通过MCODE插件识别PPI网络中的功能模块。同时，通过Metascape平台对交集靶点进行基因本体（gene ontology, GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析，以预测SSNX治疗MI/RI涉及的细胞组分、分子功能、生物学过程和信号通路。
3. 分子对接
基于富集分析和MCODE模块分析结果，选取线粒体自噬相关靶点PTEN诱导激酶1（PTEN-induced putative kinase 1, PINK1）、Parkin、FUN14结构域蛋白1（FUN14 domain containing 1, FUNDC1）及Bcl-2/E1B-19 kDa相互作用蛋白3（Bcl-2/E1B-19 kDa interacting protein 3, BNIP3），从PDB数据库获取其晶体结构，利用AutoDock软件与SSNX的活性成分进行分子对接，以结合能评估分子间的结合活性（通常结合能低于−5.0 kcal/mol表示具有良好的结合活性）。
4. 机制验证实验
为验证网络药理学预测结果，开展以下实验：(1)透射电子显微镜观察：心肌组织以3%戊二醛和1%四氧化锇固定，经醋酸铀酰染色、梯度酒精脱水、环氧树脂包埋后超薄切片，在透射电镜下观察线粒体超微结构变化；(2)心肌ATP含量测定：取心肌组织按1:9比例加入沸腾双蒸水制成匀浆，煮沸提取后离心取上清，用酶标仪检测ATP含量；(3)线粒体膜电位检测：通过差速离心法提取心肌线粒体，采用JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位；(4)Western blot：提取心肌组织总蛋白，检测PINK1、Parkin、FUNDC1和BNIP3的蛋白表达水平，以GAPDH为内参，用Image J软件计算相对灰度值。所有数据以均值±标准差表示，采用单因素方差分析进行多组比较，P < 0.05为差异有统计学意义，使用Origin 2021软件制图。
1. SSNX显著改善小型猪MI/RI心功能并减轻心肌损伤
超声心动图结果显示，与对照组比较，模型组的LVIDs显著增大，EF和FS显著降低；与模型组比较，尼可地尔组、SSNX-tre组和SSNX-pre组的LVIDd和LVIDs均显著减小，EF和FS显著升高。其中，SSNX-pre组各项心功能指标优于SSNX-tre组和尼可地尔组。NBT染色结果表明，模型组心肌梗死面积较对照组显著增大；与模型组比较，尼可地尔组和SSNX-tre组梗死面积不同程度缩小，而SSNX-pre组的缩小心肌梗死面积效果更为明显。血清生化指标检测显示，模型组血清CK、cTnT和LDH含量较对照组显著升高；尼可地尔组、SSNX-tre组和SSNX-pre组的上述指标均有不同程度降低。
2. SSNX改善心肌组织病理结构并减轻心肌纤维化
HE染色结果显示，对照组心肌纤维排列整齐，细胞核圆形居中，无明显变性坏死及炎性细胞浸润；模型组则出现严重炎性细胞浸润、心肌细胞排列紊乱；SSNX-tre组部分心肌纤维呈片状变性坏死，伴部分纤维组织增生及炎症；SSNX-pre组大部分心肌纤维排列整齐，仅少量纤维变性坏死及轻度纤维组织增生和炎性细胞浸润。Masson三色染色结果与HE染色一致，模型组梗死区周围组织纤维化明显增多，而SSNX各组纤维化程度均有改善。
3. 网络药理学与分子对接揭示线粒体自噬为关键机制
通过PPI网络分析和MCODE算法，从PPI网络中识别出五个显著的功能模块簇，其中MCODE簇2在KEGG通路“线粒体自噬-动物”（Mitophagy-animal）上显著富集，并包含调控线粒体自噬的关键靶点PINK1、Parkin、FUNDC1和BNIP3。GO分析显示，SSNX的作用涉及细胞对化学应激的反应、对氧水平降低的应答等生物学过程，以及小窝（caveola）、膜筏等细胞组分。分子对接结果显示，63%的对接组合具有良好的结合活性，其中FUNDC1的对接效果最佳。人参皂苷Rg1、Rb1和Rb2被鉴定为与线粒体自噬相关的关键活性成分。
4. SSNX保护线粒体结构与功能并抑制线粒体自噬
透射电镜观察显示，模型组心肌肌丝明显断裂或疏松，线粒体肿胀增大甚至空泡化，内部结构松散，心肌组织和线粒体内可见自噬体形成；尼可地尔组、SSNX-tre组和SSNX-pre组的上述改变显著减轻，线粒体相对完整，嵴结构疏松程度较轻，自噬体结构明显减少。生化检测表明，模型组心肌ATP含量和线粒体膜电位较对照组显著降低；SSNX各组上述指标均显著升高，且改善效果优于尼可地尔组。Western blot结果显示，模型组PINK1、Parkin、BNIP3和FUNDC1蛋白表达较对照组显著升高；与模型组比较，尼可地尔组和SSNX-pre组四种蛋白的表达均显著降低，SSNX-tre组FUNDC1和Parkin表达显著降低，而PINK1和BNIP3表达无统计学差异。上述结果综合表明，SSNX通过抑制PINK1/Parkin通路及FUNDC1和BNIP3受体介导的线粒体自噬，发挥对MI/RI小型猪线粒体结构和功能的保护作用。
本研究通过整合网络药理学与体内实验验证，首次在三七药物组合的小型猪MI/RI模型上证实：SSNX能够显著改善心功能、缩小心肌梗死面积、减轻心肌组织病理损伤及纤维化。该保护作用的核心机制与抑制过度激活的线粒体自噬密切相关——SSNX通过下调PINK1、Parkin、FUNDC1和BNIP3蛋白表达，改善线粒体超微结构，提高心肌ATP含量，维持线粒体膜电位，从而保护线粒体功能。本研究的科学价值在于：从“成分-靶点-通路-疾病”的多层次网络角度，系统揭示了SSNX抗MI/RI的物质基础和作用机制，为中药复方多靶点治疗缺血性心脏病提供了方法学范式。其应用价值体现在：为SSNX作为MI/RI临床干预药物的开发提供了扎实的临床前证据，也为中医药防治心肌缺血再灌注损伤开辟了以线粒体自噬为靶点的新思路。