本研究由来自中国药科大学（State Key Laboratory of Natural Medicines, New Drug Screening and Pharmacodynamics Evaluation Center, China Pharmaceutical University）的骆志杰（Zhijie Luo）和张婷婷（Tingting Zhang）作为共同第一作者，王新智（Xinzhi Wang）和刘军（Jun Liu）作为共同通讯作者完成，并得到了王鹏璐（Penglu Wang）、袁丁祎（Dingyi Yuan）、金莎莎（Shasha Jin）、邸建文（Jianwen Di）、马瑞雪（Ruixue Ma）和杨璐（Lu Yang）的贡献。该研究成果已发表在化学研究领域知名期刊《Chemical Research in Toxicology》上，文章在线发表日期为2024年，文章ID为10.1021/acs.chemrestox.4c00449。

此项研究聚焦于自身免疫性疾病系统系红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus， SLE）的发病机制与创新治疗策略。SLE是一种累及多系统、多器官的自身免疫性疾病，其核心特征之一是B细胞产生大量致病性自身抗体，导致组织器官损伤。目前，SLE的治疗药物主要包括传统的抗炎药、免疫抑制剂和生物制剂，但前两者特异性低、长期使用副作用大，而后者（主要是单克隆抗体）虽然特异性高，但存在给药不便和价格昂贵等问题。因此，探寻新的、更优的治疗靶点和药物是当前SLE研究的重要方向。

V-结构域免疫球蛋白T细胞激活抑制因子（V-domain immunoglobulin suppressor of T-cell activation， VISTA）是一种负性免疫检查点调节剂，在维持免疫稳态中起关键作用。既往研究表明，VISTA缺陷会加速狼疮易感小鼠的疾病进程，而使用VISTA激动性抗体则能在狼疮样小鼠模型中显示出治疗效果。然而，VISTA如何影响SLE中的免疫代谢过程，其具体分子机制尚不清楚。此外，SLE患者的T细胞（尤其是CD4+ T细胞）存在代谢重编程现象，其中脂质代谢紊乱在SLE的发病和进展中扮演着重要角色。本研究旨在探究VISTA是否通过调控CD4+ T细胞的脂质代谢影响SLE进程，并基于此，评估已获批的抗流感药物巴洛沙韦酯（Baloxavir Marboxil, BXM）作为VISTA小分子激动剂在治疗SLE中的疗效与机制，从而为SLE提供新的治疗思路和候选药物。

研究的工作流程严谨而系统，主要包含以下多个环节：首先，研究人员通过非靶向代谢组学技术分析野生型（WT）和VISTA敲除（KO）小鼠来源的活化CD4+ T细胞，以探究VISTA对细胞代谢谱的影响。实验对象为从小鼠脾脏中经负向磁珠分选纯化得到的CD4+ T细胞（纯度>95%），随后用抗CD3和抗CD28抗体刺激活化48小时。利用超高效液相色谱-三重四级杆飞行时间质谱（UHPLC-Triple TOF）平台检测细胞代谢物，通过正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）和变量重要性投影（VIP）值筛选差异代谢物，并结合一维和二维统计分析确定最可靠的差异代谢物。KEGG通路分析用于探究受影响的代谢途径。其次，在发现脂代谢通路改变的基础上，研究聚焦于显著升高的溶血磷脂酰胆碱（Lysophosphatidylcholine， LPC）。研究人员检测了WT和VISTA KO小鼠CD4+ T细胞中LPC合成相关酶（如cPLA2， LP-PLA2）以及乳糖神经酰胺（LacCer）代谢相关酶（如N-SMase， β-1,4半乳糖基转移酶）的mRNA表达水平。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清液中LPC的分泌量。同时，研究了LPC与CD40配体（CD40L）表达的关系，通过流式细胞术检测细胞表面CD40L蛋白表达，并用ELISA检测上清液中可溶性CD40L（sCD40L）的水平。实验设置了对照组、LPC处理组进行对比。第三，为了评估VISTA激动剂BXM的体内疗效，研究采用了两种经典的狼疮样疾病小鼠模型。第一个模型是慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease， cGVHD）模型。实验对象为雌性CB6F1小鼠，随机分为正常对照组、模型组、阳性药环磷酰胺（CTX）治疗组和BXM治疗组（50 mg/kg/天，灌胃给药）。模型组、阳性药组和BXM组小鼠通过尾静脉注射来自Balb/c小鼠的混合淋巴细胞悬液以诱导疾病。在建模后第七周开始给药治疗，持续四周。实验期间定期收集小鼠尿液检测尿蛋白、尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）水平；治疗结束后，收集血清检测抗双链DNA（anti-dsDNA）抗体和总免疫球蛋白G（IgG）水平；取脾脏、肾脏等器官进行称重计算脏器指数；肾脏组织进行苏木精-伊红（H&E）、过碘酸雪夫（PAS）染色评估病理损伤，并通过免疫荧光染色检测IgG沉积。第二个模型是自发狼疮样疾病的MRL/Mpj-Faslpr/J（MRL/lpr）小鼠。实验对象为12周龄雌性MRL/lpr小鼠，分为模型组和BXM治疗组（50 mg/kg/天，灌胃给药），以同龄C57BL/6小鼠作为正常对照。治疗持续六周，监测指标与cGVHD模型类似，并额外通过流式细胞术分析了脾脏中免疫细胞亚群（如浆细胞样树突状细胞、中性粒细胞、CD4+ T细胞等）的比例及VISTA在CD4+ T细胞上的表达变化。第四，为了阐明BXM发挥治疗作用的分子机制，研究人员在两种模型小鼠的肾脏组织中，通过定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测了LPC合成关键酶基因（LP-PLA2）、LacCer合成关键酶基因（β-1,4半乳糖基转移酶、N-SMase）、CD40L以及非经典核因子-κB（noncanonical NF-κB）通路相关基因的mRNA表达。同时，利用蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术检测了肾脏组织中CD40L蛋白以及非经典NF-κB通路关键蛋白p100/p52的表达水平。所有实验数据均以均值±标准误表示，采用GraphPad Prism软件进行统计分析，包括非配对t检验、单因素方差分析及多重比较检验等，p值小于0.05被认为具有统计学意义。

研究取得了丰富而连贯的结果。代谢组学分析显示，与WT组相比，VISTA KO小鼠活化的CD4+ T细胞代谢谱发生显著改变，OPLS-DA模型能清晰区分两组。筛选出的差异代谢物中，包括LPC、磷脂酰胆碱、乳糖神经酰胺在内的多种脂质代谢物在VISTA KO组显著升高。KEGG通路分析也证实甘油磷脂代谢和鞘脂代谢通路发生了改变。这表明VISTA缺陷会促进CD4+ T细胞中的脂质代谢。进一步的机制探索发现，VISTA KO组CD4+ T细胞中LPC合成关键酶LP-PLA2的mRNA表达显著上调，细胞上清液中LPC的分泌量也相应增加。同时，VISTA KO组的活化CD4+ T细胞表面CD40L蛋白表达和上清液中sCD40L水平均显著高于WT组。更重要的是，在体外用LPC处理WT小鼠的活化CD4+ T细胞，也能显著上调CD40L蛋白和sCD40L的分泌。这一系列结果构成了清晰的逻辑链条：VISTA缺陷通过上调LP-PLA2的表达，促进了CD4+ T细胞中LPC的合成；而增加的LPC进而上调了CD40L的表达。这为后续的体内治疗研究提供了直接的分子机制假说。

在cGVHD狼疮样小鼠模型中，BXM治疗显示出与阳性药CTX相当的疗效。与模型组相比，BXM治疗组小鼠的脾脏肿大得到改善；尿蛋白、尿素氮、肌酐水平显著下降；血清中anti-dsDNA抗体和总IgG水平也显著降低。肾脏病理学检查（H&E和PAS染色）显示，模型组小鼠肾小球增大、结构不清，肾间质有大量炎性细胞浸润和淀粉样沉积，而BXM治疗组肾脏病理损伤基本恢复正常。免疫荧光染色也证实BXM治疗减少了肾脏中的IgG沉积。这些结果表明，BXM能有效减轻cGVHD模型小鼠的自身抗体产生、肾功能损伤和肾脏病理改变。在MRL/lpr自发狼疮模型中，BXM同样取得了显著的治疗效果。治疗六周后，BXM组小鼠脾脏、胸腺和肠系膜淋巴结肿大的情况得到改善；尿蛋白/肌酐比值、尿素氮、肌酐以及血清anti-dsDNA和IgG水平均显著低于模型组；肾脏病理损伤和IgG沉积也明显减轻。流式细胞术分析进一步揭示，BXM治疗降低了MRL/lpr小鼠脾脏中致病性免疫细胞的比例，包括浆细胞样树突状细胞（pDCs）、中性粒细胞、单核髓系来源抑制细胞（M-MDSC）和CD4+ T细胞，同时上调了CD4+ T细胞表面VISTA的表达。这说明BXM能够调节异常的免疫细胞分布并激活VISTA通路。

分子机制层面的探究结果与体外发现相互印证。在两种狼疮样模型小鼠的肾脏组织中，BXM治疗均能显著下调LPC合成关键酶（LP-PLA2）、LacCer合成关键酶（β-1,4半乳糖基转移酶、N-SMase）、CD40L以及非经典NF-κB通路相关基因的mRNA表达。Western Blot结果显示，模型组小鼠肾脏中CD40L蛋白以及非经典NF-κB通路蛋白p100/p52的表达水平显著升高，而BXM治疗能有效抑制这些蛋白的表达。这些体内数据表明，BXM通过激动VISTA，抑制了LPC的合成，进而下调了CD40L的表达，并最终抑制了非经典NF-κB通路的异常活化，从而实现对狼疮样疾病的治疗作用。

本研究的结论具有重要意义。该研究首次将免疫检查点VISTA与脂质代谢联系起来，揭示了一条全新的VISTA调控SLE的分子通路：VISTA能够抑制小鼠CD4+ T细胞中LPC的合成，而LPC的减少会进一步抑制CD40L的表达以及下游非经典NF-κB通路的激活，从而延缓SLE的疾病进程。这为理解SLE的免疫代谢发病机制提供了新的视角。在应用价值方面，研究首次发现并证实已获批的抗流感药物巴洛沙韦酯（BXM）可以作为VISTA的小分子激动剂，在两种不同的狼疮样小鼠模型中均展现出良好的治疗效果，能够有效改善自身抗体产生、肾功能损伤、肾脏病理改变以及免疫细胞亚群失衡。这为SLE的治疗提供了极具潜力的老药新用（Drug Repurposing）候选策略。BXM作为一种口服小分子药物，相较于现有的单克隆抗体类药物，可能在给药便利性和成本上具有优势，为该研究成果的未来临床转化奠定了基础。

本研究的亮点突出。首先，在科学发现上具有显著的新颖性，首次建立了“VISTA – 脂代谢（LPC） – CD40L – 非经典NF-κB通路”这一全新的调控轴，深化了对SLE免疫代谢机制的认识。其次，在研究策略上，成功运用了老药新用的思路，通过虚拟筛选、表面等离子共振等技术发现BXM是VISTA的激动剂，并将其疗效拓展到自身免疫性疾病领域，体现了转化医学的价值。第三，研究设计系统且严谨，从体外细胞代谢组学、分子机制探索，到两种不同机制的体内疾病模型验证，形成了完整的证据链，结论可靠。最后，研究不仅揭示了新机制，还提供了具有明确应用前景的治疗候选药物（BXM），兼具理论创新和潜在临床应用价值。

此外，研究中还提到了一些有价值的发现，例如VISTA缺陷也影响了乳糖神经酰胺（LacCer）等鞘脂代谢，而LacCer能激活cPLA2进一步促进LPC合成，这可能构成了一个脂质代谢的正反馈环路。同时，研究观察到BXM治疗降低了脾脏中pDCs等产生I型干扰素（IFN-I）的关键细胞比例，提示其作用可能也涉及IFN-I通路，这与团队之前关于VISTA激动剂的研究相呼应，展示了治疗机制的复杂性。这些发现为进一步深入研究VISTA在SLE及其他自身免疫病中的作用开辟了更多方向。