本文由Xiaonan Kang、Dan Wang、Lu Zhang、Teng Huang、Siyue Liu、Xiaohui Feng、Yaoyao Guo、Ziyin Zhang、Zhongjing Wang*、Huihui Ren*以及Gang Yuan共同完成，其中标注星号()的Zhongjing Wang、Huihui Ren和Gang Yuan为通讯作者。研究团队主要来自华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌科、国家代谢性疾病临床医学研究中心湖北分中心以及武汉市中心医院内分泌科。这项原创性研究发表于《Molecular Medicine》期刊的2023年第29卷第118期。
该研究属于神经科学、内分泌学与代谢疾病领域的交叉研究，特别聚焦于2型糖尿病(T2D)相关的神经系统并发症——糖尿病性脑病(DE)及其向阿尔茨海默病(AD)发展的潜在机制。研究背景在于，2型糖尿病已被公认为阿尔茨海默病的独立风险因素，AD甚至被称为“3型糖尿病”。糖尿病性脑病表现为认知功能障碍，其核心病理变化之一是tau蛋白的异常过度磷酸化，这与AD的病理特征高度重叠。临床上，目前对于糖尿病性脑病缺乏有效的治疗手段。艾塞那肽-4(Exendin-4, Ex-4)作为一种广泛用于治疗2型糖尿病的胰高血糖素样肽-1受体激动剂药物，先前研究已发现其对糖尿病性脑病具有神经保护作用，能够改善tau蛋白过度磷酸化和认知障碍。然而，其发挥作用的精确分子机制尚不明确。特别地，大脑内源性胰岛素对于维持神经元功能和抑制tau蛋白磷酸化至关重要，但在2型糖尿病状态下，外周胰岛素很难通过血脑屏障进入大脑，导致脑内胰岛素相对缺乏。因此，研究旨在探索Ex-4是否以及如何通过激活特定的信号通路，来促进大脑自身产生胰岛素，进而发挥神经保护作用，为糖尿病性脑病乃至阿尔茨海默病的治疗提供新的理论依据和潜在靶点。
本研究采用了一套从整体动物到离体细胞的系统性、多层次研究策略，工作流程严谨而详细。
首先，在动物模型层面，研究使用了两种不同的2型糖尿病小鼠模型： 一种是遗传性的db/db小鼠（每组5只，共25只），另一种是通过高脂饮食联合链脲佐菌素诱导的高脂-糖尿病小鼠（每组10只，共60只）。这两类模型分别模拟了不同的2型糖尿病发病机制。研究人员将这些小鼠随机分为多个干预组，包括：疾病对照组（皮下及鼻内给予生理盐水）、Ex-4单独治疗组（皮下注射Ex-4）、Ex-4联合DKK1治疗组（皮下注射Ex-4 + 鼻内给予Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK1）、皮下胰岛素阳性对照组（仅皮下注射胰岛素以控制外周血糖）以及鼻内胰岛素阳性对照组（仅鼻内给予胰岛素以直接提升脑内胰岛素水平）。所有干预持续4周。在干预期间，定期监测小鼠体重和血糖。干预结束后，通过两项标准行为学测试评估小鼠的认知功能：新物体识别测试用于评估识别记忆能力，记录小鼠探索新物体与旧物体的时间和次数；Morris水迷宫测试用于评估空间学习和记忆能力，记录小鼠寻找隐藏平台的逃逸潜伏期、游泳速度、在目标象限停留时间及穿越平台次数等参数。行为学测试完成后，收集小鼠脑脊液，使用酶联免疫吸附测定法检测其中的胰岛素和C肽水平，以评估脑内胰岛素来源（C肽与胰岛素等分子分泌，是内源性胰岛素生成的标志）。随后处死小鼠，取大脑组织，分离海马体。一部分海马体用于蛋白质和mRNA提取，另一部分用于制作石蜡切片。
其次，在细胞模型层面，研究选用了小鼠海马神经元细胞系HT22。 为了模拟2型糖尿病下的慢性高葡萄糖损伤，设置了正常葡萄糖对照组、高葡萄糖损伤组以及高葡萄糖联合Ex-4处理组。此外，为了探究特定分子的功能，研究团队还构建了多种基因修饰的HT22细胞系，包括：使用慢病毒介导的短发夹RNA技术敲低胰岛素编码基因Ins2的细胞；使用慢病毒分别过表达和敲低转录因子NeuroD1的细胞；以及利用Wnt/β-catenin通路抑制剂DKK1进行预处理的细胞。
再者，在分子机制探究层面，研究采用了一系列生化和分子生物学实验技术： 1. 蛋白质印迹法： 用于检测海马组织或HT22细胞中tau蛋白在Ser199、Ser202、Ser396和Thr217位点的磷酸化水平、总tau蛋白、Wnt/β-catenin通路活性标志物非磷酸化β-catenin、胰岛素信号通路关键分子磷酸化AKT和磷酸化GSK-3β的水平，以及NeuroD1的蛋白表达量。 2. 实时定量聚合酶链式反应： 用于检测海马组织或HT22细胞中Ins2基因和NeuroD1基因的mRNA表达水平。 3. 免疫组织化学和免疫荧光染色： 用于在脑组织切片上直观显示磷酸化tau蛋白的分布，以及在脑组织或HT22细胞中观察胰岛素、β-catenin、NeuroD1的定位和表达情况。 4. 染色质免疫沉淀-定量PCR： 用于验证NeuroD1转录因子是否直接结合到Ins2基因的启动子区域，并比较不同处理组中这种结合强度的变化。 5. 荧光素酶报告基因实验： 为了进一步确认NeuroD1对Ins2启动子的调控作用，研究人员构建了含有Ins2基因野生型启动子或突变型启动子（针对预测的NeuroD1结合位点）的报告基因质粒，与NeuroD1过表达质粒共转染HT22细胞，检测荧光素酶活性，以反映启动子转录活性。
最后，在数据分析方面， 所有实验均独立重复至少三次。数据以均值±标准差表示。两组间比较采用双尾Student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析结合Tukey事后检验。使用GraphPad Prism软件进行统计分析，显著性水平设定为p<0.05。
研究取得了系统性的成果，各部分结果逻辑严密，层层递进。
第一，Ex-4能够显著改善2型糖尿病模型中的tau蛋白过度磷酸化。 在db/db小鼠、高脂-糖尿病小鼠的脑组织以及高糖损伤的HT22细胞中，均观察到tau蛋白在多个AD相关位点（Ser199, Ser202, Ser396, Thr217）的磷酸化水平显著升高。而经过Ex-4治疗后，这种异常磷酸化在所有模型中均得到了显著抑制。这初步证实了Ex-4对糖尿病相关tau病理的有效改善作用。
第二，Ex-4通过促进大脑内源性胰岛素生成来发挥作用，且这一过程依赖于Wnt/β-catenin通路的激活。 动物实验数据显示，Ex-4治疗能显著提升糖尿病小鼠脑脊液中的胰岛素和C肽水平，增加海马体中胰岛素免疫荧光信号，并上调海马体中Ins2基因的mRNA表达。同时，胰岛素信号通路关键分子p-AKT和p-GSK-3β的活性得到恢复。然而，当使用DKK1抑制Wnt/β-catenin通路后，Ex-4带来的上述所有有益效应（包括胰岛素水平升高、胰岛素信号通路激活以及tau磷酸化降低）均被显著阻断或削弱。在细胞实验中，高糖损伤降低了HT22细胞中非磷酸化β-catenin的水平及其核转位，而Ex-4处理逆转了这一现象，并同样被DKK1所拮抗。这强烈提示，Ex-4需要激活Wnt/β-catenin通路，才能进而促进脑内Ins2基因的表达和胰岛素的生成。
第三，Ex-4改善了2型糖尿病小鼠的认知功能障碍，且此改善作用也依赖于Wnt/β-catenin通路。 行为学测试结果与新物体识别测试显示，糖尿病小鼠对新物体的探索时间和次数减少，提示识别记忆受损；Ex-4治疗可恢复这种探索偏好，但联合DKK1则无效。Morris水迷宫测试显示，糖尿病小鼠寻找隐藏平台的逃逸潜伏期延长，在目标象限停留时间减少；Ex-4治疗显著改善了这些空间记忆指标，而DKK1同样阻断了这种改善。这证明，Ex-4通过激活Wnt/β-catenin通路来提升脑内胰岛素，不仅能缓解分子层面的tau病理，还能切实改善动物整体的认知行为。
第四，转录因子NeuroD1是Ex-4发挥上述作用的关键下游分子。 研究发现，在糖尿病小鼠海马组织和高糖损伤的HT22细胞中，NeuroD1的蛋白和mRNA表达均下降，而Ex-4处理可使其上调。这种上调作用同样可被DKK1抑制。功能获得和功能缺失实验证实了NeuroD1的核心地位：在HT22细胞中过表达NeuroD1，即使在高糖环境下也能增加胰岛素生成；反之，敲低NeuroD1后，Ex-4便无法发挥其促进胰岛素生成、激活胰岛素信号通路以及降低tau磷酸化的作用。
第五，Ex-4通过促进NeuroD1与Ins2基因启动子的结合来调控胰岛素生成。 机制研究的最后一步揭示了更精细的分子事件。通过生物信息学预测和实验验证（染色质免疫沉淀-定量PCR），研究人员发现NeuroD1能够结合到Ins2基因的启动子区域。高糖损伤削弱了这种结合，而Ex-4处理则能显著增强NeuroD1与Ins2启动子的结合。进一步的荧光素酶报告基因实验表明，当NeuroD1结合位点发生突变时，Ex-4对Ins2启动子活性的提升作用大大减弱。这直接证明了Ex-4 → Wnt/β-catenin通路激活 → NeuroD1表达上调和核转位 → NeuroD1结合Ins2启动子 → Ins2转录增强 → 胰岛素合成增加 → 胰岛素信号通路激活 → GSK-3β活性抑制 → tau磷酸化降低，是一条完整的信号传导轴。
本研究得出的核心结论是：在2型糖尿病背景下，Ex-4通过激活海马神经元中的Wnt/β-catenin信号通路，上调其下游转录因子NeuroD1的表达。NeuroD1进入细胞核后，直接与胰岛素编码基因Ins2的启动子区域结合，从而促进大脑内源性胰岛素的合成与分泌。增加的脑内胰岛素进而激活PI3K/AKT信号通路，抑制糖原合成酶激酶-3β的活性，最终导致与阿尔茨海默病相关的tau蛋白过度磷酸化水平下降，并改善由此引发的认知功能障碍。
这项研究的科学价值和应用意义重大。在理论层面，它首次系统性地阐明了Ex-4改善糖尿病相关tau病理和认知障碍的一条全新且完整的分子机制——Wnt/β-catenin/NeuroD1/Ins2信号轴。这深化了我们对胰高血糖素样肽-1受体激动剂在中枢神经系统保护作用机制的理解，特别是明确了其促进大脑“自产”胰岛素的能力，为解决2型糖尿病中脑内胰岛素相对缺乏这一难题提供了新的思路。同时，该研究将代谢性疾病（糖尿病）与神经退行性疾病（阿尔茨海默病）在分子通路上更紧密地联系起来，为“糖尿病是阿尔茨海默病风险因素”这一流行病学发现提供了坚实的实验生物学证据。在应用层面，该研究指出了Wnt/β-catenin信号通路、转录因子NeuroD1以及Ins2基因均可作为干预糖尿病性脑病乃至预防其向阿尔茨海默病发展的潜在新靶点，为未来开发新的治疗策略奠定了重要的理论基础。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先，研究发现了全新的作用机制，即Ex-4通过Wnt/β-catenin/NeuroD1通路促进脑内胰岛素生成，这是该领域此前未报道过的清晰信号路径。其次，研究设计系统且严谨，采用了两种体内动物模型和一种体外细胞模型进行相互验证，并结合了基因敲低、过表达、通路抑制剂、行为学、分子互作验证等多种技术手段，从整体表型到细胞分子机制，再到蛋白-DNA相互作用，层层深入，证据链完整。再次，明确了内源性胰岛素的关键作用，通过Ins2敲低实验直接证明了Ex-4的效应依赖于大脑自身合成的胰岛素，而非外周来源，这一点对于理解药物如何跨越血脑屏障难题具有重要意义。最后，具有明确的转化医学潜力，所揭示的信号通路节点为未来的药物研发提供了新的方向。
此外，论文作者也客观地讨论了本研究的局限性，例如实验仅使用了雄性小鼠、主要模拟了“原发性”糖尿病性脑病、研究聚焦于海马区而未涉及其他可能合成胰岛素的大脑区域、生命体调控的复杂性意味着可能还存在其他并行通路等。这些讨论为后续研究指明了方向。研究者提出，未来可在临床研究中通过检测脑脊液或血液中的磷酸化tau蛋白生物标志物、胰岛素/C肽水平以及认知量表评分，来间接验证这一通路在人体中的相关性。