一项靶向癌胚抗原阳性转移性结直肠癌的嵌合抗原受体T细胞疗法I期剂量递增试验
主要作者包括来自第三军医大学西南医院生物治疗中心的张成成、钱程，来自西南医院肿瘤科的梁后杰，以及来自德国柏林夏里特医学大学血液学、肿瘤学与肿瘤免疫学诊所的Gabriele Pecher等。该研究发表于Molecular Therapy杂志，2017年5月第25卷第5期，在线发布日期为2017年3月。
研究背景
过继性T细胞免疫治疗被认为是一种有前景的抗肿瘤治疗策略。经基因改造可表达嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）的T细胞能够通过抗原—抗体识别方式结合肿瘤抗原，从而直接识别并杀伤肿瘤细胞，无需抗原呈递过程，也不受主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制。CAR-T疗法已在CD19阳性的血液系统恶性肿瘤中显示出良好的抗肿瘤效果和较高的完全缓解率。然而，其在实体瘤中的应用仍面临较多挑战。虽然已有研究针对人表皮生长因子受体2、碳酸酐酶IX、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、双唾液酸神经节苷脂和白细胞介素13受体α2等多个肿瘤相关抗原开展了CAR-T治疗实体瘤的探索，但总体疗效仍不令人满意，且部分研究观察到在靶/脱瘤毒性。因此，需要更多临床试验来改进CAR-T技术的安全性和有效性。
CEA是胃肠癌的敏感肿瘤生物标志物，在结直肠癌组织和血清中广泛表达。大多数正常成人组织中检测不到CEA表达，仅在胃肠道上皮细胞面向肠腔的顶端表面存在低水平表达，这种表达位置对免疫细胞不可见，因此CEA成为CAR-T治疗的潜在靶点。此前已有研究通过肝动脉输注方式进行了靶向CEA的CAR-T治疗，但其后6例患者中仍有5例出现疾病进展。本研究旨在通过静脉全身输注方式，对CEA阳性转移性结直肠癌患者进行CEA CAR-T治疗的I期临床试验，以评估其安全性和初步疗效。
研究流程
本研究为一项I期剂量递增临床试验，注册号为NCT02349724。试验纳入了10例复发难治性且伴有转移的CEA阳性结直肠癌患者。入组患者需有可测量病灶，且曾接受至少一线全身治疗失败。所有患者在入组前需完成抗肿瘤治疗2周以上。CEA表达强度通过免疫组织化学确认并分为三个等级。患者还需满足心脏、血液、肝肾功能等多项入组标准。
试验流程包括入组筛查、CAR-T细胞制备、淋巴细胞清除、CAR-T细胞回输及随访评估几个阶段。CAR-T制备周期约为2周。输注前1天对细胞产品进行流式细胞术质量控制检测。淋巴细胞清除持续5天，前4例患者接受较低剂量环磷酰胺（300 mg/m²/天，连用3天），其余患者接受较高剂量环磷酰胺（900 mg/m²/天，连用3天），所有患者均在最后2天接受氟达拉滨（25 mg/m²/天）。完成淋巴细胞清除后，在细胞输注前进行血液学评估以确认患者耐受性。试验设置了5个剂量水平（dose levels，DLs）：1×10⁵、5×10⁵、1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸ CAR+细胞/kg。为了安全起见，每个剂量水平计划入组3例患者，其中DL4因1例新入组患者在淋巴细胞清除前退出而仅有2例受试者。CAR-T细胞分3天输注，第1天输注总剂量的10%，第2天30%，第3天60%。4例患者接受了第二次不同剂量的输注，两次输注间隔超过6周。
CAR-T细胞的制备过程为：采集患者外周血，分离外周血单个核细胞，使用固定化CD3和CD28抗体激活T细胞，在第2天用慢病毒载体转导T细胞，随后在含白细胞介素-2的培养基中扩增约12—14天。所用慢病毒载体携带BW431/26单链可变片段—IgG4铰链区—CD28跨膜域—CD28—CD3ζ的CAR结构。转导后及输注前均通过流式细胞术检测CAR阳性率及T细胞、NK细胞、NKT细胞比例，并检测记忆T细胞亚群和免疫检查点分子表达。CAR-T细胞的细胞毒性通过针对不同CEA表达水平的肿瘤细胞系进行验证。
在细胞输注后，研究团队进行了为期4周的每周随访，监测不良事件、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）及15种细胞因子水平。通过流式细胞术和定量PCR检测外周血中CAR-T细胞的持续存在情况，并对部分患者的肿瘤活检组织进行CD3免疫组织化学染色及CAR基因拷贝数检测。疗效评估采用免疫相关反应评价标准，同时监测血清CEA及多种糖类抗原水平的变化。
主要研究结果
在安全性方面，未观察到与CAR-T治疗相关的严重不良事件。接受最高剂量DL5的患者中，有2例出现39℃至40℃的发热，非甾体抗炎药可缓解。多数患者出现3/4级淋巴细胞计数下降，这主要归因于淋巴细胞清除预处理。1例患者在输注后第20天发生十二指肠穿孔，但穿孔部位标本中未发现CD3阳性细胞，判定与CAR-T治疗无关。未观察到结肠炎，即使在最高剂量输注下也未出现胃肠道毒性。
在CRP和细胞因子监测中，大多数患者在输注后第1周内表现为单峰型CRP升高。白细胞介素-6的变化趋势与CRP相似。对CRP和15种细胞因子的Spearman相关分析显示，干扰素-γ与除IP-10和Mig外的所有因子均相关，提示干扰素-γ可能是比CRP更敏感的细胞因子释放综合征指标。
在临床疗效评估中，10例患者中有7例既往治疗后疾病进展的患者，在接受CAR-T治疗后达到疾病稳定。2例患者保持疾病稳定超过30周，其中1例超过34周。2例患者分别通过PET/CT和MRI观察到肿瘤缩小。1例接受DL5治疗的患者在PET/CT上显示肿瘤代谢活性明显减弱，标准摄取值最大值从7.38降至5.80。另1例接受DL4治疗的患者通过MRI观察到肝脏病灶缩小。大多数患者血清CEA水平出现明显下降，且在长期观察中仍持续下降。
在外周血CAR-T细胞持续存在方面，流式细胞术未能检测到CAR-T细胞，但定量PCR检测显示接受较高剂量（DL3—DL5）治疗的患者外周血中CAR基因拷贝数明显增加。多数患者在输注后迅速出现拷贝数峰值，部分患者在数周后出现第二次峰值。接受第二次CAR-T治疗的患者中，高剂量组显示出持续的较高拷贝数水平。但所有患者的拷贝数在输注后4—6周均降至检测不到的水平。肿瘤组织检测显示，3例患者的转移灶中均检测到CD3阳性T细胞浸润，其中2例患者肿瘤组织中CAR基因拷贝数分别为1029.22和983.29拷贝/mg基因组DNA。免疫组织化学显示T细胞在肿瘤间质中的聚集明显多于实质。
在外周血单个核细胞表型分析中，髓源性抑制细胞和调节性T细胞比例以及T细胞上PD-1表达在输注后最初2周内有升高趋势。初始T细胞比例持续下降，而中央记忆T细胞和效应记忆T细胞比例有一定程度增加。
研究结论与意义
本研究证实了CEA CAR-T细胞疗法在CEA阳性转移性结直肠癌患者中即使在高剂量下也具有良好的耐受性，未出现严重CAR相关毒性。大多数治疗患者观察到一定程度的疗效，包括疾病稳定、肿瘤缩小和血清CEA水平下降。研究提示CEA是结直肠癌CAR-T治疗的安全且有潜力的靶点。此外，高剂量淋巴细胞清除方案在多数患者中可耐受，且感染可控。
研究亮点
本研究的亮点包括：首次通过静脉全身输注方式对CEA阳性结直肠癌患者进行CEA CAR-T治疗的剂量递增试验；证明了即使在高剂量下也未出现严重胃肠道毒性或结肠炎，这与既往CEA TCR-T治疗导致严重结肠炎的报告形成对比；观察到CAR-T细胞在肿瘤组织中的浸润及CAR基因拷贝数，为疗效提供了直接证据；发现干扰素-γ可能是比CRP更敏感的细胞因子释放综合征指标。
本研究的局限性在于CAR-T细胞在外周血中的扩增水平和持续时间有限，外周血CAR-T细胞数量低于流式细胞术检测灵敏度，提示未来需进一步改进CAR结构或联合其他治疗策略以增强CAR-T细胞在实体瘤中的扩增和持久性。