ATAC-seq技术：一种快速、灵敏的表观基因组分析新方法

作者及机构
本研究由斯坦福大学医学院遗传学系的Jason D. Buenrostro（第一作者）、Paul G. Giresi、Lisa C. Zaba、Howard Y. Chang（通讯作者）及William J. Greenleaf（通讯作者）团队完成，发表于2013年12月的《Nature Methods》期刊（卷10，第12期，页码1213-1218）。

学术背景
真核生物基因组通过染色质（chromatin）的层级包装实现基因调控，而染色质的可及性（accessibility）、核小体定位及转录因子（transcription factor, TF）结合状态是表观遗传信息的关键载体。传统方法（如DNase-seq、FAIRE-seq、MNase-seq）需百万级细胞且操作复杂，无法同时解析染色质开放区域、核小体位置与TF结合的相互作用，且难以应用于临床稀缺样本。为此，研究团队开发了ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing），旨在通过转座酶直接标记天然染色质，实现低细胞量（500–50,000个细胞）、高分辨率的多维表观基因组分析。

研究流程与方法
1. 实验设计
- 样本类型：人类淋巴母细胞系GM12878（ENCODE Tier 1标准细胞）、健康志愿者外周血CD4+ T细胞。
- 核心步骤：
- 细胞核制备：裂解细胞后分离核，避免固定以保持染色质天然状态。
- 转座反应：使用超活性Tn5转座酶（携带测序接头）在开放染色质区域插入接头，生成片段化DNA文库。此步骤仅需30分钟，显著快于传统方法。
- PCR扩增：通过qPCR动态监测扩增循环数，避免GC偏好性，最终文库纯化后用于测序。

1. 数据分析
   
   • 数据比对：使用Bowtie将测序数据比对至hg19基因组，调整读段位置以反映Tn5二聚体插入的9 bp间隔。
     
   • 开放区域检测：采用ZINBA算法（窗口300 bp）调用峰值，结合插入片段长度分布区分功能区域（如启动子、增强子）。
     
   • 核小体定位：根据片段长度分类（<100 bp为无核小体区域，180–247 bp为单核小体等），结合DANPOS工具生成核小体信号轨迹。
     
   • TF足迹分析：利用CENTIPEDE算法整合序列 motif、进化保守性及ATAC-seq插入缺失信号，推断TF结合位点。
     

主要结果
1. 开放染色质检测的高灵敏度
- ATAC-seq在50,000个细胞中信号噪声比与DNase-seq相当，但所需细胞量低3–5个数量级（图1b）。仅需500个细胞仍可检测开放区域（图1c），但灵敏度随细胞量减少而降低。
- 插入片段长度分布显示约200 bp周期性（图2a），对应核小体保护长度，且不同功能区域（如CTCF结合区、转录起始位点TSS）具有特异性片段富集模式（图2b）。

1. 核小体定位与TF结合模式

   • ATAC-seq可精准解析调控区域的核小体排布。例如，一个双向启动子区域显示两个无核小体区间被单个核小体分隔（图3a），与MNase-seq相比更聚焦于开放区域（图3b）。
     
   • TF结合与核小体的空间关系分为四类（图3e）：严格避开核小体（如c-Fos）、贴近核小体边缘（如CTCF）、部分重叠（如RNA聚合酶II）及与异染色质相关（如CHD1）。
     

2. 临床应用的可行性

   • 对志愿者连续3天的CD4+ T细胞分析显示，ATAC-seq可在275分钟内完成从采血到测序（图5a），并鉴定出IL2基因的NFAT特异性调控（图5c），为个体化治疗提供依据。
     
   • 通过足迹分析构建89个TF的调控网络，揭示T细胞与B细胞的特异因子（如NFAT）差异（图5d）。
     

结论与意义
ATAC-seq通过单次实验同步获取染色质可及性、核小体定位及TF结合信息，突破了传统方法的高细胞量限制，为表观遗传学研究提供了高效工具。其快速、低样本需求的特点使其适用于临床个体化表观基因组分析（如疾病诊断或药物靶点筛选），并为发育、癌症等领域的机制研究开辟新途径。

研究亮点
1. 方法创新：首次将Tn5转座酶直接应用于天然染色质，简化文库构建流程至两步（转座+PCR）。
2. 多维数据整合：通过片段长度与插入位点解析染色质状态与TF结合的动态互作。
3. 临床转化潜力：证明其在稀有样本（如血液）中的实用性，支持“个人表观基因组”快速生成。

其他价值
ATAC-seq可结合流式分选（FACS）或显微切割技术，用于稀有细胞亚群研究，未来或推动癌症、自身免疫疾病等领域的精准医学发展。