类型a：学术研究报告

作者及机构
本研究由Lin Rao、Liping Cai和Lusheng Huang共同完成，研究团队来自中国科学技术部猪遗传改良与种质创新国家重点实验室（江西农业大学）。研究成果发表于2023年的《Science Bulletin》期刊（第68卷，2583–2597页）。

学术背景
肝脏是代谢和免疫的核心器官，但其在出生后的单细胞分辨率发育动态仍不清楚。尽管小鼠肝脏发育的批量转录组研究已有报道，但猪作为更接近人类的模型，其肝脏发育的细胞异质性、代谢与免疫功能的时空变化尚未系统解析。本研究旨在通过单细胞核转录组测序（single-nucleus RNA-seq, snRNA-seq）和单细胞转录组测序（single-cell RNA-seq, scRNA-seq）技术，构建出生后猪肝脏发育的高分辨率图谱，揭示肝细胞、内皮细胞、间质细胞和免疫细胞的动态变化规律，并挖掘调控肝脏发育的关键转录因子（transcription factors, TFs）和细胞间互作机制。

研究流程
1. 样本采集与处理
- 研究对象：7头巴马香猪（Bamaxiang pig），覆盖4个发育阶段：哺乳期（30天，d30）、断奶后（d42）、快速生长期（d150）和成年期（d730）。
- 样本制备：取右外侧叶（right lateral lobe, RLL）组织，分别进行snRNA-seq（分离细胞核）和scRNA-seq（完整细胞）。snRNA-seq通过10x Genomics平台完成，scRNA-seq使用SeekGene技术。

1. 数据生成与质控

   • 测序数据：共获得84,824个细胞/核的转录组数据（snRNA-seq: 32,131个核；scRNA-seq: 52,693个细胞）。
     
   • 质控标准：过滤低质量细胞（如线粒体基因占比>25%或双细胞预测分数>0.25），并进行批次校正（Harmony算法）和整合（Mutual Nearest Neighbors, MNN）。
     

2. 细胞类型注释与亚群分析

   • 聚类与标记基因：通过Louvin聚类和UMAP降维，鉴定出23种细胞类型，包括肝细胞（hepatocytes）、胆管细胞（cholangiocytes）、肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells, LSECs）等。
     
   • 稀有细胞类型：发现浆细胞样树突细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDCs）、CAVIN3+IGF2+内皮细胞（cavin3+igf2+ endothelial cells）和EBF1+成纤维细胞（ebf1+ fibroblasts），后者通过多重免疫组化（multiplex immunohistochemistry, mIHC）验证。
     

3. 发育轨迹与调控网络

   • 肝细胞异质性：将肝细胞分为9个亚群，例如合成多不饱和脂肪酸的HEP1（高表达FADS1/FADS2）和合成饱和脂肪酸的HEP5/HEP6（高表达FASN）。
     
   • 伪时间分析：通过Monocle2构建发育轨迹，发现33个与肝细胞成熟相关的TFs（如NFIL3调控代谢）。
     
   • 内皮细胞分区：成年猪LSECs中鉴定出新型TF LUZP2，其表达随发育上调，并通过snATAC-seq（单细胞染色质可及性测序）和mIHC验证其特异性。
     

4. 免疫细胞动态

   • 主导免疫群体：淋巴样细胞（NK/T细胞）从d30起主导肝脏免疫系统。
     
   • 组织驻留NK细胞（tissue-resident NK cells, trNKs）：具有病毒防御功能，成年期仍保持增殖能力（高表达STMN1/HMGB2），且其转录因子表达模式（如EOMEShigh/TBX21low）与人类更相似。
     

5. 细胞互作分析

   • 配体-受体对：发现肝细胞与非实质细胞（non-parenchymal cells, NPCs）通过WNT2-FZD5/LRP5、HGF-MET等通路互作，调控代谢分区和铁稳态。
     

主要结果
1. 肝细胞代谢成熟：伪时间分析显示，成年肝细胞富集尿素循环和胆固醇代谢通路，而幼年肝细胞偏向多不饱和脂肪酸合成。
2. LSECs的发育调控：LUZP2是成年LSECs的特异性TF，可能通过Hippo通路调控肝脏大小。
3. 免疫微环境演化：trNKs的保守性提示猪是研究人类肝脏免疫的理想模型。
4. 跨物种保守性：猪与人类肝脏内皮细胞的分区模式（如EFNB2在门静脉区）部分保守，但基因表达差异显著。

结论与价值
本研究首次在单细胞分辨率下解析了猪出生后肝脏发育的代谢与免疫动态，填补了大型哺乳动物肝脏发育图谱的空白。科学价值包括：
1. 发育生物学：揭示肝细胞和LSECs的成熟调控机制，如LUZP2和NFIL3的作用。
2. 转化医学：猪trNKs与人类的相似性为免疫治疗研究提供新模型。
3. 方法学创新：结合snRNA-seq和scRNA-seq，克服了肝细胞脆性对单细胞测序的限制。

研究亮点
1. 稀有细胞发现：鉴定出CAVIN3+IGF2+内皮细胞和EBF1+成纤维细胞。
2. 跨技术验证：通过mIHC、snATAC-seq等多组学数据交叉验证结果。
3. 应用潜力：为肝脏疾病建模（如纤维化）和异种移植研究提供基础数据。

其他价值
研究公开了数据集（GSA: CRA012286），并开发了分析流程（如PySCENIC调控网络分析），助力后续研究。