本研究的通讯作者为来自清华大学/北京生命科学研究所的许默（Mo Xu）教授和来自中国科学院生物物理研究所的高朴（Pu Gao）教授。其他主要作者包括史可建、吕垚、赵春秋等，他们分别来自北京师范大学、清华大学/北京生命科学研究所、中国科学院生物物理研究所等单位。这项研究于2025年9月11日发表在学术期刊《Nature》的第645卷。
这项研究属于免疫学和过敏性疾病研究领域。研究人员旨在探究一个长期悬而未决的核心科学问题：自然界中能够诱发过敏性气道炎症（例如哮喘）的过敏原（如花粉、尘螨、霉菌孢子等）在结构和生物学特性上高度多样化，它们为何能引发相似的2型免疫反应？传统的1型和3型免疫依赖于模式识别受体感知病原体的保守分子特征，而2型免疫被认为是通过感知组织结构受破坏这种“共同扰动”来启动的。然而，这种“共同扰动”的具体形式及其被气道上皮细胞感知的机制尚不明确。气道上皮细胞作为防御第一线，虽然已知能通过特定受体（如TLR4、PAR2等）识别部分过敏原，但如何识别缺乏这些特征的大量其他过敏原仍是谜团。本研究以常见的霉菌过敏原——链格孢菌（Alternaria alternata）为模型，目标是识别这些多样化过敏原共有的免疫刺激特征，并揭示气道上皮细胞感知这些特征、从而启动2型免疫反应的内在机制。
研究流程系统而严谨，主要包含以下几个关键部分。
首先，研究人员建立了一个体外模型来模拟体内早期反应。他们使用A. alternata提取物处理小鼠气道，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离上皮细胞并进行基因表达谱分析，确认了早期反应包括：白细胞介素-33（IL-33）的释放、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路（特别是MEK1/2和ERK1/2的磷酸化）的激活，以及多种炎症基因（如CCL24, AREG等）的表达。值得注意的是，MAPK激活和炎症基因表达在IL-33缺陷小鼠中依然发生，表明存在不依赖于IL-33的平行通路。随后，他们利用人肺上皮细胞系（NCI-H1437和NCI-H292）成功在体外复现了这些早期反应，并构建了稳定表达IL-33-荧光素酶（IL-33-Luc）融合蛋白的报告细胞系，用以便捷地监测IL-33释放。这一体外系统为后续的生物化学分馏提供了关键的读数（readout） assays。
其次，他们利用建立的体外读数系统，对A. alternata提取物中的免疫刺激活性成分进行了六步生化纯化。纯化步骤包括：65%硫酸铵沉淀、Hitrap S阳离子交换层析、Mono S阳离子交换层析、Superdex 75凝胶过滤层析、Mono Q阴离子交换层析和Superdex 200凝胶过滤层析。在Superdex 75步骤中，他们发现单独的洗脱组分（低分子量组分A9-A12和高分子量组分A4-A6）均无活性，但将两者混合后活性恢复，表明活性需要两种蛋白组分的协同作用。通过后续纯化和质谱鉴定，最终确定了这两个核心组分：一个16.5 kDa的蛋白，属于Aegerolysin家族，命名为Aeg-S；一个55 kDa的蛋白，含有膜攻击复合物/穿孔素（MACPF）结构域，命名为Aeg-L。两者均无信号肽但能以非经典方式分泌。序列分析表明，编码这两个蛋白的基因在A. alternata基因组中位置相邻，且类似的二元穿孔蛋白（pore-forming proteins, PFPs）在曲霉菌（Aspergillus）和青霉菌（Penicillium）等其他主要霉菌过敏原中也广泛存在。
第三，在鉴定出Aeg-S和Aeg-L后，研究人员对其功能和作用机制进行了深入探索。他们制备了重组蛋白，通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了Aeg-S/Aeg-L复合物的高分辨率结构。结构显示，该复合物形成一个由18个Aeg-L亚基和36个Aeg-S亚基组成的跨膜孔道，呈18倍对称的环状结构，内径约92 Å。Aeg-L在成孔过程中发生构象变化，其N端结构域的两个延伸区域解折叠并重排为插入细胞膜的β发夹结构。体外实验证实，Aeg-S和Aeg-L能特异性结合含有鞘磷脂和胆固醇的脂质体，并形成孔道。在肺上皮细胞中，Aeg-S和Aeg-L必须同时存在才能诱导一系列反应：低浓度时激活MAPK通路和炎症基因表达；高浓度时则触发IL-33释放和细胞裂解性死亡。使用钙离子螯合剂BAPTA-AM和EGTA的实验证明，细胞膜穿孔导致细胞外钙离子（Ca2+）内流，这对于激活下游MAPK通路和炎症基因表达至关重要。此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF被发现能共价修饰Aeg-S和Aeg-L，从而非特异地抑制其成孔活性，这解释了之前观察到的AEBSF能抑制霉菌过敏性的部分机制。
第四，研究人员在体内验证了Aeg-S和Aeg-L的功能。给小鼠鼻内滴注重组Aeg-S和Aeg-L蛋白，6小时后即可在气道观察到与天然霉菌提取物类似的早期反应：上皮细胞MAPK通路激活、炎症基因表达以及BALF中IL-33等炎症介质的释放。这些反应在IL-33缺陷或淋巴细胞缺陷的小鼠中依然存在，证实了上皮细胞自主的、不依赖免疫细胞反馈的激活机制。更关键的是，对小鼠进行为期两周的反复滴注后，Aeg-S和Aeg-L联合处理（而非单独处理）能成功诱发典型的过敏性气道炎症，表现为肺组织中2型辅助T细胞（Th2）和嗜酸性粒细胞显著浸润，以及血清免疫球蛋白E（IgE）水平升高。此外，当将Aeg-S/Aeg-L与卵清蛋白（OVA）等抗原共同滴注时，它们能作为特异性的2型免疫佐剂，诱导抗原特异性的Th2细胞和IgE反应，但不促进Th1或Th17反应，而经典佐剂脂多糖（LPS）则诱导Th1/Th17反应。这表明Aeg-S/Aeg-L介导的膜穿孔是一种“真正的”2型免疫佐剂。
第五，为了确证Aeg-S和Aeg-L在天然霉菌过敏原性中的核心作用，研究人员利用基因编辑技术构建了Aeg-S基因（aegs）和Aeg-L基因（aegl）敲除的A. alternata菌株。体外实验表明，敲除菌株的提取物完全丧失了诱导上皮细胞IL-33释放、MAPK激活和细胞死亡的能力，而回补相应的重组蛋白则可恢复这些活性。体内实验得到了决定性证据：与野生型霉菌提取物相比，敲除菌株的提取物无法在小鼠气道引发早期免疫激活；经过两周反复暴露后，也完全不能诱导Th2细胞、嗜酸性粒细胞浸润和血清IgE升高等过敏性炎症。回补重组蛋白则能完全恢复敲除菌株的过敏原性。这直接证明Aeg-S和Aeg-L的成孔活性是A. alternata诱发过敏所必需的。
第六，研究进一步将发现推广到更广泛的穿孔蛋白。他们选取了来自不同物种、具有不同结构和膜靶点的多种穿孔蛋白（如烟曲霉的Niga2/Nigb1、海葵的Equinotoxin II、蚯蚓的Lysenin、产气荚膜梭菌的Perfringolysin O等）进行测试。尽管这些蛋白结构各异，但鼻内滴注后，它们都能在小鼠中有效诱发过敏性气道炎症，并引起类似的早期上皮反应（IL-33释放和IL-33非依赖的MAPK激活）。这强有力地证明，气道上皮细胞的膜穿孔本身，是一种能被先天免疫系统识别的、跨越结构差异的“共同危险信号”，足以启动2型免疫反应。
本研究的主要结果环环相扣，逻辑严密。体外模型的建立和生化纯化成功鉴定出Aeg-S/Aeg-L这一对核心刺激成分。结构生物学阐明了它们形成跨膜孔道的分子基础。机制研究表明，孔道形成通过两条并行途径激活免疫：一是直接导致细胞损伤和IL-33等警报素（alarmin）释放；二是引起Ca2+内流，进而激活MAPK信号通路，驱动炎症基因表达。体内功能实验证明，这对蛋白不仅是霉菌提取物中必要的过敏原成分，其本身也足以在呼吸道作为2型免疫佐剂诱发完整过敏反应。基因敲除霉菌的实验提供了最直接的遗传学证据，确立了成孔活性在霉菌致敏中的核心地位。最后，多种异源穿孔蛋白的验证将发现提升为一个普适性机制：气道上皮细胞能够感知膜穿孔这一“共同扰动”，从而将结构多样的穿孔蛋白统一识别为一类过敏刺激物。
研究的结论是，霉菌过敏原A. alternata通过其分泌的穿孔蛋白Aeg-S和Aeg-L在气道上皮细胞膜上形成孔道，这种膜穿孔是启动过敏性气道炎症的关键事件。穿孔通过触发IL-33释放和Ca2+内流/MAPK激活双通路，引发上皮细胞炎症信号，进而招募和激活免疫细胞，建立2型免疫应答。更重要的是，该研究揭示了一个普适性的2型先天免疫感知原理：结构多样的穿孔蛋白，通过造成气道上皮细胞膜穿孔这一共同的物理化学扰动，被识别为过敏信号。这为“2型免疫感知组织损伤”的理论提供了具体的分子和细胞机制范例。
本研究的科学价值重大。它首次明确鉴定了一种跨越不同过敏原的共性免疫刺激特征——膜穿孔活性，并完整揭示了从上皮细胞感知穿孔到启动2型炎症的详细信号传导通路。这深化了对过敏启动机制，特别是“损伤模式”感知的理解。在应用价值方面，该研究为过敏性疾病的治疗提供了新的潜在靶点，例如针对下游的Ca2+信号或MAPK通路进行干预。同时，Aeg-S/Aeg-L作为特异性2型免疫佐剂的发现，也对疫苗研发具有启示意义。
该研究的亮点突出：第一，发现了霉菌过敏原中此前未知的核心致敏成分（Aeg-S/Aeg-L），并利用遗传学敲除模型提供了确凿证据。第二，创新性地将冷冻电镜结构解析、钙成像、特异性佐剂功能验证等多种技术结合，系统阐明了“穿孔-感知-反应”的全链条机制。第三，最重要的亮点是其发现的普适性——将单一霉菌模型中的机制，成功推广至多种结构迥异的穿孔蛋白，确立“膜穿孔”作为2型免疫感知的共性危险信号，这是一个概念上的重要突破。第四，研究还澄清了先前抑制剂AEBSF作用机制中存在的混淆，指出其同时抑制穿孔蛋白活性和丝氨酸蛋白酶的双重作用。
此外，研究在讨论部分还提出了一个富有深意的未来方向：穿孔蛋白通常主要激活1型和3型免疫以抵抗感染，为何在气道环境下却特异性地驱动2型免疫？这暗示组织微环境或伴随的其他炎症信号可能决定免疫应答的类型，为后续研究留下了有趣的问题。这项研究不仅解开了特定霉菌过敏的分子之谜，更为我们理解机体如何感知五花八门的过敏原并启动过敏反应，提供了一个全新的、统一的理论框架。