本次由Anna A. Zmijewska、Jaroslaw W. Zmijewski、Eugene J. Becker Jr.、Gloria A. Benavides、Victor Darley-Usmar和Roslyn B. Mannon共同完成的研究，于2021年发表在*American Journal of Transplantation*期刊上。研究团队主要来自美国阿拉巴马大学伯明翰分校的肾病学部、肺与危重病医学科、病理学系，以及伯明翰退伍军人医疗中心。

该研究隶属于移植医学和肾脏病学领域，旨在深入探究钙调神经磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitors, CNIs）介导的肾毒性背后的分子机制。CNIs，如环孢素A（cyclosporine A, CsA）和他克莫司（tacrolimus, Tac），是实体器官移植后普遍使用的强效免疫抑制剂，能有效预防排斥反应，提高移植物短期存活率。然而，其长期使用与显著的肾毒性相关，包括肾小管损伤、间质纤维化，最终导致晚期移植物功能丧失。尽管这是临床移植领域一个长期未满足的重大需求，但其确切机制复杂，且缺乏有效的干预手段和特异的早期生物标志物。先前研究表明，CNI肾毒性与氧化应激、细胞凋亡和内质网应激等有关，但线粒体功能障碍、代谢重编程以及损伤相关分子模式（DAMPs）释放在此过程中的具体作用和联系尚不明确。本研究提出假设：CNI介导的肾毒性与线粒体氧化还原态失衡和生物能量适应不良有关，进而引发组织重塑和包括高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1, HMGB1）在内的有害介质释放。因此，研究的核心目标是阐明CNI诱导肾小管上皮细胞损伤的详细机制，特别是线粒体功能、代谢变化与HMGB1释放之间的关联，并探索MAPK/ERK1/2信号通路作为潜在治疗靶点的可能性。

研究采用了体外细胞实验和体内小鼠模型相结合的综合方法，流程严谨且层层递进。第一部分：体外细胞模型建立与初步表型观察。 研究使用人原代近端肾小管上皮细胞（human proximal tubular epithelial cells, HPTECs）作为主要研究对象，同时辅以人肾小管上皮细胞系HK-2、小鼠内髓集合管细胞IMCD3和原代小鼠近端肾小管上皮细胞（MPTECs）。细胞暴露于不同浓度和时间梯度的CsA或Tac处理。首先，通过免疫荧光染色和蛋白质印迹法（Western blot）检测HMGB1的亚细胞定位（核-质转位）及其在细胞培养上清液中的释放情况。这是研究的切入点，旨在确认CNI处理是否能触发这一关键的DAMP释放事件。第二部分：探究细胞死亡模式与HMGB1释放的关系。 在明确了CNI能诱导HMGB1释放的基础上，研究进一步区分了凋亡与非凋亡浓度CNI的作用。使用凋亡标志物cleaved PARP来界定凋亡状态，并应用泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK和坏死性凋亡抑制剂Nec-1，来探究HMGB1释放是主动过程还是被动过程。第三部分：评估CNI对肾小管上皮细胞表型的影响。 通过显微镜观察细胞形态变化，并利用Western blot检测上皮细胞表型标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）和紧密连接蛋白Claudin-2的表达水平，以评估CNI是否导致上皮-间质转化（EMT）或细胞间粘附丧失。第四部分：深入解析CNI诱导的线粒体功能障碍与代谢重编程。 这是机制研究的核心环节。使用荧光探针H2DCF-DA和MitoSOX分别检测细胞内总活性氧（ROS）和线粒体特异性超氧阴离子水平。通过线粒体追踪染料观察线粒体网络形态（是否发生碎片化）。更重要的是，采用Western blot定量分析线粒体电子传递链（electron transport chain, ETC）各复合体关键亚基（如复合体I的NDUFB8、复合体II的Fp、复合体IV的亚基I等）的蛋白表达。同时，使用Seahorse细胞能量代谢分析仪实时监测细胞的氧消耗率（OCR，反映氧化磷酸化水平）和细胞外酸化率（ECAR，反映糖酵解水平），从而全面评估细胞的生物能量状态和代谢途径偏好。第五部分：探究CNI激活的信号通路及其对HMGB1释放的调控。 通过Western blot检测CNI处理后ERK1/2和AKT的磷酸化水平（即激活状态）。随后，使用特异性的ERK1/2抑制剂PD0325901和PI3K/AKT抑制剂LY294002进行预处理，再观察它们对CNI诱导的HMGB1核质转位及释放的影响，以确定关键的上游信号分子。此外，还测试了其他促炎因子（TNF-α, IL-1β, IFN-γ）和促纤维化因子TGF-β1对HMGB1释放的诱导作用，以评估其普适性。第六部分：体内小鼠模型验证。 建立已报道的CNI肾毒性小鼠模型。C57BL/6小鼠在低盐饮食基础上，每日腹腔注射CsA（60 mg/kg）或Tac（1 mg/kg），持续2或4周。通过质谱法检测血清肌酐评估肾功能；收集肾脏组织进行苏木精-伊红（HE）和过碘酸雪夫（Periodic Acid Schiff, PAS）染色，进行肾小管损伤评分（评估空泡化、萎缩、扩张和坏死）；通过免疫荧光染色观察肾脏皮质和髓质中HMGB1的亚细胞定位；通过Western blot检测小鼠尿液中HMGB1的含量，旨在将体外发现转化为体内可检测的生物标志物。同时，检测肾脏组织中炎症因子（IL-6, TNF-α）、氧化应激标志物（NOX2磷酸化p47phox, HO-1）、纤维化标志物（α-SMA, TGF-β1, S100A4）以及线粒体ETC蛋白的表达变化。第七部分：体内药理学干预。 为了验证体外发现的治疗靶点，在小鼠模型中联合给予ERK1/2抑制剂PD0325901（2.5 mg/kg, i.p.）与CNI，持续2周，评估其对肾功能、肾组织损伤、肾内HMGB1定位及尿HMGB1水平的影响。所有数据统计分析均使用GraphPad Prism软件，多组比较采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验，两组比较采用Student t检验。

研究取得了系统且具有说服力的结果。关于HMGB1释放： 体外实验明确显示，非凋亡浓度的CsA和Tac即可引起HPTECs中HMGB1显著的核-质转位和胞外释放，且这一现象具有剂量和时间依赖性，并在多种肾小管上皮细胞系中得到验证。当使用促凋亡浓度CNI时，HMGB1释放更为显著。Z-VAD-FMK能部分抑制此释放，而Nec-1不能，甚至增强了释放，这表明在CNI诱导的早期，HMGB1主要通过凋亡相关的主动机制释放，而非坏死性凋亡。关于上皮表型丧失： CNI处理导致HPTECs形态改变，出现拉长、片状伪足，细胞间连接丢失。Western blot证实E-cadherin和Claudin-2蛋白表达下降，表明CNI损害了肾小管上皮细胞的完整性和极性与粘附特性。关于线粒体与代谢机制： CNI处理导致HPTECs内ROS水平显著升高，线粒体网络发生碎片化。Western blot显示线粒体ETC复合体I、II、IV的关键亚基蛋白表达量普遍下降。Seahorse能量代谢分析提供了关键证据：CNI处理降低了细胞的基础OCR、最大OCR、ATP关联OCR和线粒体储备能力，表明氧化磷酸化受损。与此同时，细胞的ECAR升高，糖酵解能力增强。这揭示了一个重要的适应（或 maladaptation）过程：CNI诱导了线粒体生物能量功能障碍，迫使细胞从高效的氧化磷酸化代谢转向效率较低但快速的糖酵解代谢，即发生了“Warburg效应”类似的代谢重编程。这种代谢转换可能在早期帮助细胞存活，但长期可能导致能量供应不足和功能异常。关于信号通路调控： CNI能迅速且短暂地激活ERK1/2和AKT信号通路。药理学抑制实验发现，ERK1/2抑制剂PD0325901能有效阻断CNI诱导的HMGB1核转位和释放，而AKT抑制剂LY294002则不能，明确了ERK1/2是此过程的关键上游激酶。此外，促炎因子和TGF-β1也能诱导HMGB1释放，提示在体内复杂的微环境中，多种因素可协同放大这一效应。关于体内验证： 小鼠模型成功复制了CNI肾毒性，表现为血清肌酐升高、肾小管损伤评分增加。免疫荧光显示，CNI处理小鼠的肾脏皮质和髓质上皮细胞中，HMGB1出现明显的核外弥散，核内信号减弱或消失，与体外观察一致。更重要的是，在CNI处理2周和4周的小鼠尿液中，检测到了显著升高的HMGB1蛋白，表明尿HMGB1可作为CNI肾毒性的一个早期、无创的生物标志物。肾脏组织分析进一步显示，CNI处理伴随炎症、氧化应激和促纤维化信号通路的激活，以及组织中线粒体ETC蛋白的减少。关于治疗潜力验证： 体内干预实验取得了积极结果：与单独使用CNI相比，联合给予ERK1/2抑制剂PD0325901能显著减轻肾小管损伤、降低血清肌酐水平、减少肾脏组织内HMGB1的核质转位，并降低尿液中HMGB1的积聚。这直接证明了靶向ERK1/2信号通路可以有效缓解CNI介导的肾毒性和HMGB1释放。

本研究的结论是，CNI（CsA和Tac）通过一个共同的机制导致肾小管上皮细胞损伤：即诱发线粒体功能障碍、氧化应激和生物能量适应不良（代谢向糖酵解重编程），进而激活促重塑的MAPK/ERK1/2信号通路。ERK1/2的激活以及（在高浓度下的）凋亡进程，共同介导了HMGB1从肾小管上皮细胞中的主动释放。释放的HMGB1作为一种关键的DAMP，可能进一步加剧局部炎症和组织损伤，形成恶性循环。研究首次将线粒体代谢紊乱、ERK信号激活和HMGB1释放这三个环节系统地联系在一起，为理解CNI肾毒性提供了新的分子病理学框架。基于此，作者提出了两个重要的潜在临床应用方向：第一，尿HMGB1水平有望成为一个敏感、无创的早期生物标志物，用于监测移植受者的CNI肾毒性风险，实现个体化免疫抑制方案的调整。第二，靶向MAPK/ERK1/2信号通路或线粒体氧化还原/生物能量稳态，是缓解CNI介导肾毒性的有前景的治疗策略。

本研究的亮点在于：1. 机制阐述的系统性与创新性： 首次全面揭示了CNI肾毒性与线粒体生物能量代谢重编程、ERK1/2信号通路激活以及HMGB1释放之间的因果链条，构建了一个从细胞器功能障碍到信号传导，再到损伤介质释放的完整机制模型。2. 研究方法的综合性： 熟练结合了体外原代细胞、细胞系模型和体内动物模型，并运用了免疫荧光、Western blot、Seahorse细胞能量代谢分析、液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）等多种技术，从分子、细胞、组织到整体功能水平进行了多维度验证。3. 转化医学价值突出： 不仅阐明了机制，更直接验证了ERK1/2抑制剂的治疗潜力，并提出了尿HMGB1作为生物标志物的概念，具有明确的临床转化前景。4. 对临床争议的启示： 研究发现CsA和Tac在诱导线粒体损伤和HMGB1释放机制上相似，提示二者肾毒性的根本机理可能共通，为临床比较两种药物的长期肾毒性提供了新的分子视角，而非仅仅关注表观病理差异。

此外，研究还指出了一些有价值的发现：例如，非凋亡浓度下的代谢重编程是一种细胞试图存活的适应性反应；TGF-β1也能诱导HMGB1释放，这可能将CNI肾毒性与最终的间质纤维化结局更紧密地联系起来；线粒体靶向抗氧化剂等干预线粒体功能的策略，也可能是未来值得探索的治疗方向。这项研究为改善长期移植受者的预后提供了重要的科学依据和新的思路。