《RNA Atlas研究：扩展人类非编码RNA目录及功能解析》

第一作者及机构
本研究由Lucia Lorenzi（比利时根特大学医学遗传学中心、根特癌症研究所）和Hua-Sheng Chiu（美国贝勒医学院德州儿童癌症中心）作为共同第一作者领衔，联合来自Illumina公司、VIB-UGent医学生物技术中心、澳大利亚电子健康研究中心等20余家国际机构的科研团队共同完成。研究成果于2021年11月发表于Nature Biotechnology期刊（Volume 39, Pages 1453–1465）。

学术背景

研究领域与动机
本研究属于转录组学（Transcriptomics）与非编码RNA（ncRNA）功能研究交叉领域。尽管RNA测序技术已能解析人类转录组的核苷酸分辨率，但现有ncRNA目录仍存在两大局限：
1. 技术偏差：既往研究主要依赖小RNA（small RNA）和聚腺苷酸化RNA（polyA RNA）测序，导致非聚腺苷酸化（non-polyA）和环状RNA（circRNA）的系统性研究不足；
2. 功能空白：大量ncRNA的调控机制及其与蛋白质编码基因（PCGs）的互作网络尚未明确。

研究目标
团队旨在通过多技术整合测序，构建更全面的人类转录组图谱，并揭示ncRNA在基因调控中的功能。

研究流程与方法

1. 样本与测序策略
- 样本库：收集300例人类样本，包括45种组织、162种细胞类型和93种细胞系（含89种癌细胞系）。
- 多组学测序：对每例样本并行开展三类测序：
- 小RNA测序（298样本，中位数深度1300万读长）；
- polyA RNA测序（295样本，6000万读长）；
- 总RNA测序（296样本，1.25亿读长）。
- 技术优势：总RNA测序首次实现非polyA转录本和内含子覆盖度的系统性检测。

2. 转录组组装与注释
- 参考数据库：以Ensembl v86和GENCODE v33为基准，整合FANTOM5、CHESS等公共数据。
- 新转录本鉴定：通过StringTie组装新基因，利用CAGE测序和染色质状态（chromatin states）验证转录活性。
- 分类标准：将基因分为三类：
- 已注释基因（annotated，如99%的PCGs）；
- 既往报道基因（prerep，如38%的lincRNAs）；
- 本研究独有基因（RNA Atlas-only，如27%的lincRNAs）。

3. 功能证据挖掘
- circRNA鉴定：通过反向剪接位点（back-splice）识别38,023个候选circRNA，其中98%源自PCG宿主基因。
- miRNA预测：结合miRBase v22和miRDeep2，发现3,567个新型miRNA（73%未被其他数据库收录）。
- 单外显子lincRNA验证：通过链特异性测序和qPCR排除DNA污染假阳性，证实4,877个单外显子lincRNA的真实性。

4. 调控网络分析
- pre-mRNA/mRNA比值（m/p ratio）：利用总RNA测序的内含子覆盖度，区分转录调控（TF作用）与转录后调控（miRNA作用）。
- 算法工具：开发Longhorn算法，预测lncRNA通过四种模式调控靶基因：
- 转录共因子（co-factor）；
- 转录引导子（guide）；
- TF诱饵（decoy）；
- miRNA/RBP诱饵（post-transcriptional decoy）。

主要结果

1. 扩展的ncRNA目录
- 新增8%的ncRNA：包括5,471个RNA Atlas-only lncRNA，其中89%为单外显子基因。
- 非polyA转录本：48%的lincRNA和37%的asRNA无polyA尾，填补既往技术盲区。
- 新型PCG候选：通过CPAT、PhyloCSF和质谱验证，发现104个潜在PCG，20个在人类蛋白质组图谱中检测到肽段。

2. 细胞类型特异性表达
- 上皮/间质细胞标记：42个miRNA和141个单外显子lincRNA在特定细胞亚型中高表达（log2FC>3，FDR<0.01）。
- circRNA表达特征：仅1%高丰度circRNA呈现细胞类型特异性，提示其量化需更高测序深度。

3. 调控功能证据
- miRNA靶向验证：211个miRBase miRNA和105个新型miRNA显著调控靶基因的m/p比值（p<0.05）。
- lncRNA功能分类：
- 转录调控主导：79%单外显子lncRNA和88%多外显子lncRNA参与TF调控；
- circRNA作为诱饵：21个circRNA富集于转录后调控。
- 通路富集：3,310个lncRNA靶向17条 hallmark 通路（如p53、MYC、TGF-β），其中增殖和信号通路最显著。

结论与价值

科学意义
1. 技术突破：首次整合多RNA测序技术，系统性解析非polyA和环状转录本。
2. 功能解析：通过m/p比值和Longhorn算法，为ncRNA调控机制提供多维度证据。
3. 资源开放：所有数据发布于R2平台（http://r2platform.com/rna_atlas），支持后续研究。

应用前景
- 疾病标志物：细胞类型特异性ncRNA或为癌症诊断提供新靶点；
- 基因治疗：如lncRNA SAMMSON（黑色素瘤依赖基因）的靶向干预潜力。

研究亮点

1. 多组学整合：首次联合small RNA、polyA和总RNA测序，覆盖全转录组多样性。
   
2. 单外显子lncRNA验证：通过实验排除DNA污染，确立其生物学真实性。
   
3. 算法创新：Longhorn首次实现lncRNA调控模式的系统预测。
   
4. 动态polyA分析：揭示hist1h2bd等基因存在polyA状态转换的异构体差异。
   

其他价值
- 数据可重用性：提供38,023个circRNA、5,213个miRNA的完整表达谱；
- 方法学通用性：m/p比值分析框架可推广至其他物种或疾病模型。