研究背景

恶性黑色素瘤是一种高度侵袭性、易快速转移的皮肤恶性肿瘤，死亡率极高。目前，手术切除仍是其标准治疗手段，但术后残余的微小病灶往往导致局部复发和远处微转移，尤其对于高危II/III期患者，复发率可高达70%。术后免疫治疗虽被用于降低复发风险，但肿瘤免疫原性低下以及术后形成的免疫抑制性肿瘤微环境（immunosuppressive tumor microenvironment，ITM）严重削弱了机体抗肿瘤免疫应答的效力。此外，术后大范围创面存在细菌感染风险，不仅延迟组织修复，也增加了术后并发症的可能。因此，如何在抑制肿瘤复发的同时促进感染性创面愈合，成为黑色素瘤术后管理面临的核心挑战。光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD），激活抗肿瘤免疫，同时具有抗菌潜力。然而，肿瘤细胞通过上调谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）活性合成大量谷胱甘肽（glutathione，GSH）以清除ROS，维持氧化还原稳态，削弱PDT疗效。同时，谷氨酰胺代谢在M2型肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）极化中发挥关键作用。此外，活化的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）分泌的干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）可上调肿瘤细胞程序性死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）表达，引发适应性免疫抵抗。基于上述多重机制，本研究开发了一种负载三元无载体纳米粒（CJCNPs）的GelMA水凝胶免疫治疗敷料，旨在通过协同调控谷氨酰胺代谢、光动力效应和PD-L1表达，实现术后黑色素瘤的复发抑制与创面修复双重目标。

研究设计与方法

研究团队首先通过纳米沉淀法将光敏剂二氢卟吩e6（chlorine e6，Ce6）、溴结构域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）抑制剂JQ1和谷氨酰胺酶抑制剂C968按1：1：1投料比自组装形成无载体纳米粒CJCNPs。透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）和动态光散射（dynamic light scattering，DLS）显示CJCNPs为粒径约98 nm的均一球形结构。紫外-可见吸收光谱、分子动力学模拟及不同溶液条件下的光谱变化证实，CJCNPs的形成主要依赖疏水作用、π-π堆积和氢键，而非静电作用。高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）测定Ce6、JQ1和C968的载药效率分别为42.94%、23.33%和33.72%。随后，将CJCNPs物理掺入甲基丙烯酸酐改性明胶（methacrylic anhydride-modified gelatin，GelMA）预聚液中，经405 nm蓝光照射原位固化形成GelMA-CJCNPs水凝胶。流变学分析表明GelMA可在50秒内光固化，压缩强度约53.5 kPa，掺入CJCNPs后水凝胶的溶胀率、成胶性能和力学性能未发生显著改变，且CJCNPs在水凝胶中能保持粒径稳定。

体外细胞实验

在细胞层面，研究团队以B16F10小鼠黑色素瘤细胞为模型，系统验证了CJCNPs的协同抗肿瘤机制。共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）显示，与游离Ce6相比，CJCNPs显著提高了肿瘤细胞对Ce6的内化效率。Western blot分析证实，JQ1和CJCNPs均可有效抑制IFN-γ诱导的PD-L1上调。C968和CJCNPs处理使细胞内GSH水平分别降至对照的71.13%和66.02%，证实谷氨酰胺代谢抑制可有效阻断GSH合成。ROS检测显示，660 nm激光照射后，Ce6（+）组和CJCNPs（+）组均产生大量ROS，但CJCNPs（+）组荧光强度更高，这表明增强的细胞摄取与GSH减少共同放大了氧化应激。活/死细胞染色和Annexin V-FITC/PI凋亡检测进一步证实，CJCNPs（+）组表现出最强的细胞杀伤和凋亡诱导能力。ICD效应评估中，CJCNPs（+）组呈现最高水平的钙网蛋白（calreticulin，CRT）膜暴露和高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）胞外释放，表明其能最有效地诱导ICD。上述体外结果为后续体内抗肿瘤实验提供了充分依据。

体内抗肿瘤免疫效应

研究团队首先构建了C57BL/6小鼠B16F10原位黑色素瘤模型，并在肿瘤部位建立直径8 mm的圆形创面以模拟临床手术场景。将PBS或不同水凝胶敷料涂覆于创面后，GelMA-CJCNPs（+）组肿瘤生长受到最显著抑制，16天时平均肿瘤体积仅约70 mm³，而PBS组增长至850 mm³。肿瘤重量方面，GelMA-CJCNPs（+）组（0.03 g）较PBS组（0.50 g）降低约94%。H&E染色显示GelMA-CJCNPs（+）组肿瘤组织出现广泛坏死，TUNEL染色呈现最强凋亡信号，Ki67阳性细胞数最少。免疫细胞分析表明，GelMA-CJCNPs（+）组淋巴结中成熟树突状细胞（dendritic cells，DCs）比例达34.5%，是PBS组的2.7倍；肿瘤浸润CD8+ T细胞比例达18.3%，为对照组的8.5倍。同时，M1/M2型TAMs比值从PBS组的0.68升至GelMA-CJCNPs组的5.3和GelMA-CJCNPs（+）组的4.5，表明谷氨酰胺代谢抑制有效重塑了免疫抑制微环境。免疫组化进一步证实，含JQ1的组别肿瘤组织PD-L1表达显著降低。RNA测序分析显示，GelMA-CJCNPs（+）组免疫系统过程调控相关基因和凋亡过程调控相关基因表达发生显著改变，TNF、CASP1和CXCL10等免疫相关基因上调，NES、TFAP4、MMP9和MYBL2等凋亡相关基因表达增加。GO和KEGG通路分析揭示TNF信号通路、IL-17信号通路和Toll样受体信号通路被显著激活，从转录组水平证实了协同免疫治疗机制。

双侧荷瘤模型与系统性免疫

为评估系统性抗肿瘤免疫效应，研究团队建立了双侧B16F10荷瘤模型：左侧背部先接种肿瘤细胞，6天后右侧接种。左侧肿瘤模拟原发灶并接受局部水凝胶治疗，右侧肿瘤作为远处转移灶观察远隔效应。结果显示，GelMA-CJCNPs（+）组原发肿瘤平均体积约30 mm³，显著低于PBS组（1060 mm³）和GelMA-Ce6（+）组（280 mm³）。远处肿瘤在GelMA-CJCNPs（+）组亦被明显抑制，平均体积约110 mm³，而对照组达590 mm³。远处肿瘤中CD8+ T细胞比例在GelMA-CJCNPs（+）组达37.3%，为PBS组的2.2倍。血清ELISA检测显示，GelMA-CJCNPs（+）组TNF-α、IFN-γ和IL-6分泌量分别为对照组的2.7、2.0和1.8倍，而IL-10水平降低，表明全身性炎症免疫应答被有效激活。

感染创面愈合

在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）感染的皮肤创面模型中，GelMA-CJCNPs（+）组在治疗后第10天创面闭合率达98.5%，显著高于对照组（82.6%）和GelMA-CJCNPs组（82.9%）。第5天创面组织细菌残留计数显示，GelMA-CJCNPs（+）组菌落数显著低于其他组。H&E和Masson染色显示该组出现明显的毛囊再生和胶原沉积，表明PDT抗菌效应有效促进了感染创面的组织修复。正常皮肤的组织学分析未发现病理改变，提示该水凝胶敷料具有良好的体内安全性。

结论与意义

本研究成功构建了一种集光动力治疗、谷氨酰胺代谢抑制和PD-L1阻断于一体的GelMA-CJCNPs免疫治疗水凝胶敷料。该平台通过抑制谷氨酰胺代谢减少GSH合成，保护PDT产生的ROS，从而放大氧化应激、增强ICD效应；同时减少M2型TAMs极化，重塑免疫抑制微环境；并通过阻断IFN-γ-BRD4-PD-L1轴克服适应性免疫抵抗。在双侧荷瘤模型中，该水凝胶不仅抑制了原发和远处肿瘤生长，还对金黄色葡萄球菌感染创面表现出显著的促愈合作用。该研究为黑色素瘤术后管理提供了一种兼具抗肿瘤免疫激活、免疫微环境重塑和抗菌促愈合功能的多功能辅助治疗平台，具有重要的临床转化潜力。

研究亮点

本研究的创新性体现在以下几个方面：其一，构建了基于Ce6、JQ1和C968的自组装无载体三元纳米粒，避免了载体材料带来的潜在毒性，实现了高效协同递药。其二，首次将谷氨酰胺代谢调控与光动力治疗和PD-L1阻断整合于同一水凝胶敷料中，实现了对肿瘤免疫原性、免疫微环境和免疫检查点的三位一体调控。其三，利用GelMA水凝胶兼具的可注射成胶性与组织黏附性，将局部治疗与系统性免疫激活有机结合，并兼顾了术后抗菌与创面修复需求。其四，通过RNA测序从全基因组水平揭示了该策略调控免疫系统和凋亡过程的分子网络，为机制阐释提供了系统层面证据。